脂肪组织冰冻切片油红O滴染法的建立

王肖燕，王金泉*，姚 刚*，张继红

(1.新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆 乌鲁木齐 830063)

脂肪组织冰冻切片油红O滴染法的建立

王肖燕1，王金泉1*，姚 刚1*，张继红2

(1.新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆 乌鲁木齐 830063)

为了提高脂肪组织冰冻切片的染色效果和效率，将传统的脂肪组织石蜡切片油红O染色法改进为冰冻切片油红O滴染法，以用于冰冻脂肪组织脂肪细胞增殖、分化的研究和脂肪相关疾病快速病理诊断。新鲜脂肪组织液氮冷冻后转入-20℃冰箱缓冲30 min，在-33℃或-34℃时进行冰冻切片，组织染色采用油红O微量滴染法。本改良的油红O滴染法能应用于冰冻脂肪组织切片染色，清楚地显示脂肪细胞的形态和脂滴的分布，有助于脂肪组织增值分化的研究和相关疾病病理切片分析。该方法快速高效、染色清晰、不易脱片，效果良好，可明显缩短实验周期和减少试剂成本，可使脂肪组织冰冻切片和油红O染色技术更广泛的应用于脂肪组织相关的科学研究和病理诊断。

脂肪组织；冰冻切片；滴染；油红O染色法

哺乳动物的脂肪组织包括白色脂肪和棕色脂肪，棕色脂肪到成年时仅占机体脂肪组织的极少比重。白色脂肪组织几乎分布于整个机体，其中皮下脂肪和内脏脂肪为主要的贮存能量的部位，肌内脂肪含量是肉质的重要决定因素之一[1]。对脂肪组织的研究显示，白色脂肪既是能量贮存器官，也是机体最大的内分泌器官[2]。白色脂肪组织的过度沉积可导致肥胖、脂肪肝和心血管疾病[3]，脂肪过度沉积同时也会导致家畜肉质下降[4]。因此，对脂肪沉积规律的研究被广大畜牧工作者所关注，对脂肪发育和细胞分子机理的研究日趋增多和深入，而脂肪组织形态学的研究为脂肪细胞的增殖、分化发育提供了有力的科学依据。

脂肪组织形态学研究的传统方法是通过石蜡切片和油红O染色。石蜡切片与冰冻切片相比存在固定、脱水、浸蜡和包埋等过程，用时较长，且如果要显示脂质则固定时间需要2～5周[4]。而传统的油红O染色中常用60%异丙醇分化和缸染[5]，易导致脂肪细胞脱落。对于临床上送检的标本，在非成批样本情况下按传统方法操作，试剂和人力成本较高。本试验运用冰冻组织切片机对脂肪组织冰冻切片技术进行了改进，并首次采用油红O滴染法代替缸染，极大地减少了制片时间和试剂消耗，取得了较好的结果。在参加中国畜牧兽医学会学术研讨会时被很多研究者关注，因此我们将方法总结如下。

1 材料与方法

1.1 脂肪样品获取

绵羊屠宰后30 min内取尾脂、肾周脂和皮下脂等不同部位脂肪组织样品，样品大小为长×宽×高=5 mm×5 mm×20 mm，迅速置于液氮中，之后转入-20℃冰箱缓冲30 min，即可进行冰冻组织切片，或者从液氮中取出后转入-80 ℃超低温冰箱保存，以备重复切片使用。

1.2 主要试剂的配制

油红O染色液：油红O储备液(BA4081，珠海贝索生物公司)60 mL，ddH2O 40 mL混合均匀，静置10 min备用。苏木素染液：苏木精(BA4081，珠海贝索生物公司)0.5 g，钾矾5 g，NaIO3 0.1 g加热溶解于70 mL ddH2O中，待完全溶解后加入甘油30 mL和冰乙酸2 mL混合均匀过滤待用，使用时按照1∶20的比例稀释。

1.3 脂肪组织冰冻切片

将液氮或-80 ℃超低温冰箱中的脂肪组织样品取出，转入-20 ℃冰箱中缓冲30 min后，再置于冷冻组织切片机(Leica CM3050S，Leica Instrument GmbH，Germany)中，切片机冰冻箱内温度提前2 h预冷至-33 ℃或-34 ℃，用OCT包埋剂将组织固定到样品托中心位置，待包埋剂发白后将样品托固定到样品台固定器上。调节刀片和组织块之间的距离，进行修片，当组织切面整齐，且可连续切出完整的组织切片时，将切片厚度调整为6 μm，去除前几张切片，之后便可贴片。贴片用载玻片置于室温下，且载玻片需提前用多聚赖氨酸处理，以防止染色时脱片，如做免疫组化实验需用免疫组化专用载玻片。贴片后不易常时间暴露在室温环境中，避免切片干燥，可置于-20 ℃冰箱中，在染色时提前取出自然晾干，待载玻片上无水汽时便可染色。

1.4 油红O滴染法

取上述贴有脂肪组织切片的载玻片自然晾干，用移液枪将60%油红O染色液300 μL左右(可视组织切片大小而加减)分别滴于切片上，室温下反应7 min，缓慢倾斜去除染液(油红O染液可回收)；滴加等量1%盐酸水分化3 s；双蒸水缓慢冲洗5 s，终止分化；苏复染核30 s；自来水冲洗返蓝1 min；阿拉伯胶封片。染色封固后的切片用数码显微拍照。

1.5 数据处理

数据用“平均数 ± 标准误”表示，统计分析采用SPSS13.0统计软件，差异显著性检验采用单因子方差分析(one-way ANOVA)，P< 0.05为差异显著，P< 0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 不同部位脂肪组织冰冻切片油红O滴染比较

采用脂肪组织冰冻切片油红O滴染法，可见正常脂肪组织细胞形状规则，染色均匀，细胞轮廓清晰，细胞核呈蓝色贴于胞膜周边，脂滴呈粉红色、完整无脱落。不同部位脂肪组织染色效果相同，细胞形态大小清晰可辨(图1)，可用于不同部位脂肪组织增殖分化的形态学比较。

图1 阿勒泰大尾羊不同部位脂肪组织冰冻切片油红O滴染法染色A.尾脂；B.皮下脂；C.肾周脂Fig.1 Oil red O drop staining on frozen section of adipose tissue in the Altay sheep.A.tail fat; B.subcutaneous fat; C.perirenal fat

2.2 阿勒泰大尾羊不同部位脂肪组织脂肪细胞面积的比较

用Advanced 3.2分析软件对6只阿勒泰大尾羊的尾脂、肾周脂和皮下脂的脂肪细胞进行了测量和比较，分析结果显示尾脂和皮下脂的脂肪细胞面积显著高于肾周脂的脂肪细胞面积，而尾脂与皮下脂间的脂肪细胞面积无显著差异。

3 讨 论

脂肪组织由脂肪细胞和极少的结缔组织构成，脂肪细胞内大部分被由甘油三酯形成的脂肪空泡所占据，细胞核和胞质较少位于周边[6]，这样的组织结构有别于肌肉和其他实质器官，因此，其染色性质具有特殊性。传统的石蜡切片存在固定、脱水、浸蜡和包埋等过程，用时较长，且容易造成脂质脱落[4,7]。如果要显示脂质则固定时间需要2～5周，耗时较长，不利于对相关疾病病理切片的及时诊断分析。而冰冻组织切片可以在较短的时间完成切片，一般熟练技术人员从采样到染色环节仅需2 h左右。脂肪组织为特殊的结缔组织，冰冻切片制作比较困难，有别于其他组织，需要注意的是切片前组织样品一定要先在-20 ℃冰箱中缓冲约30 min左右，再包埋切片，并且切片机冰冻箱内温度需控制在一个较低的温度。对于脂肪组织而言，温度过高，组织块硬度不够，切片不容易成形，厚薄不均匀，影响切片的质量。反之，温度过低，会导致组织块过硬，切片也容易碎裂。前期试验中骨骼肌组织冰冻箱内温度控制在-20℃ ～ -22 ℃[8]，有文献报道了乳腺、卵巢、子宫在-20 ～ -25 ℃；胃、肠在-18 ～ -20 ℃；甲状腺、肝、肾、脾在-15 ℃左右[9]，也有文献报道甲状腺用-20 ～ -21 ℃，脂肪样肿瘤用-25 ～ -30 ℃[10]。本研究表明，脂肪组织冰冻切片的温度控制在-33 ℃ ～ -34 ℃，切片的厚度控制在6 ～ 8 μm时，切片质量较好。

图2 不同部位绵羊脂肪细胞面积的比较**表示与肾周脂相比差异极显著(P<0.01)。Fig.2 Adipocyte area of fat tissues sheep** indicates significant difference from perirenal fat (P<0.01).

脂肪组织不仅是能量贮存器官，也是内分泌器官，可以分泌激素和其他细胞因子，如瘦素、肿瘤坏死因子、前列腺素等[11]。在研究这些因子时常用到免疫组化技术，与石蜡切片相比冰冻组织切片可以完整的保留脂肪组织中的抗原和活性物质，能够更真实的反映脂肪细胞的分泌功能。因此，脂肪组织冰冻切片将会更加广泛的应用于脂肪沉积调控机理的研究和临床疾病的诊断中。

在脂肪沉积的研究中很多都是观察脂肪细胞的形态和脂质的分布，传统的方法为油红O染色[7]。但是在染色过程中，分别用50%乙醇或60%异丙醇洗涤切片[7,12]，这样易导致切片脱落。由此，尝试省略传统染色中第一步洗涤步骤，发现最终并不影响染色质量。此外，切好的切片在室温环境放置时间过长也会导致脱落，因此要控制好切片的湿度。刚切完的切片在室温环境中放置不易超过20 min，从-20 ℃冰箱取出的切片，用肉眼观察切片上无水汽即可染色，不要过于干燥。脂肪组织冰冻切片染色的关键还是脱片和染色效果的问题，因此为了防止脱片、节省染料和精确的显示脂质的分布，我们采用了油红O滴染法，并用1%的盐酸水代替60%异丙醇分化组织。通过尝试，用1%盐酸水的刺激性小，且脂肪细胞不易脱落，不易产生沉淀。而用异丙醇易产生沉淀，并对眼睛、鼻子和咽喉产生轻微刺激，还可通过皮肤吸收对机体造成损害[7]。采用滴染法取代缸染，使每次染色试剂的使用量由数十毫升减少至数百微升。即使只有1例标本，也不会造成浪费。同时，防止了缸染时切片易脱落的弊端。

本方法能保持油红O染色效果，在不同部位脂肪组织，均能清晰地显示脂肪细胞的形态和脂质分布，其效果稳定，操作简便，用时短；并用滴染法减少试剂用量，有效防止脱片，极大地降低试验成本。

[1]Hoehne A,Number G,Kuehn C,et al.Relationships between intramuscular fat contents,selected carcass traits,and fatty acid profile in bulls using a F2-population[J].Meat Science,2011,90(3):629-635.

[2]Evan D,Rosen D,Bruce M,et al.Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis[J].Nature,2006,444(7121):847-853.

[3]鞠大鹏,詹丽杏.脂肪细胞分化及其调控研究进展[J].中国细胞生物学学报,2010,32(5):690-695.

[4]Sanudo C,Santolaria M P,Maria G,et al.Influence of carcass weight on instrumental and sensory lamb meat quality in intensive production systems[J].Meat Science,1996,42(2):195-202.

[5]周剑莉,罗新媛,周 璐.关于制作脂肪组织石蜡切片的几点体会[J].职业圈,2007,56(2):154.

[6]唐海林,唐荣军,宋 颖,等.一种改良的脂肪染色法[J].诊断病理学杂志,2006,13(2):153-154,178.

[7]Jinquan Wang,Xiaojing Yang,Qinwei Sun,et al.Maternal dietary protein induces opposite myofiber type transition in Meishan pigs at weaning and finishing stages[J].Meat Science,2011,89(2):221-227.

[8]田玉旺,李 琳,李 丽,等.介绍一种改良的油红O脂肪染色法[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2007,16(6):736.

[9]章克萍,周 莹,龙 飞,等.不同组织冰冻切片的制作方法[J].江西医学院学报,2006,48(4):13.

[10]张 亮,官泉生,彭婉芬,等.冷冻切片结合油红O染色在动脉粥样硬化小鼠模型中的应 用[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(2):210-211.

[11]杨在清,甘 莉,雷 霆,等.脂肪细胞的内分泌和自分泌/旁分泌功能[J].生命的化学,2002,55(2):129-132.

[12]侯巧燕,何 雯,张美艳,等.不同组织的快速冰冻切片技术探讨[J].广西医学,2008,30(10):1 559-1 560.

[13]李 娜.新疆褐牛四种脂代谢调控基因的表达及其与脂肪组织生物学的相关性研究[D].新疆乌鲁木齐:新疆农业大学,2013.

DropMethodofOilRedOStainingonAdiposeTissueFrozenSection

WANG Xiao-yan1,WANG Jin-quan1*,YAO Gang1*,ZHANG Ji-hong2

(1.CollegeofAnimalMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China;2.AnimalSanitarySupervisionInstituteofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830063,China)

In order to analyze the proliferation and differentiation of adipocytes,the traditional oil red O staining on paraffin section was modified as drop method on frozen section of adipose tissues and further used in cell proliferation and differentiation studies and rapid pathological diagnosis of fat-related diseases.First,fresh adipose tissues were frozen by liquid nitrogen and frozen adipose tissues shifted to -20℃ to be alleviated for 30 min.Then,serial frozen sections were cut,and stained with the drop method of oil red O staining.The morphology of adipocyte and the distribution of lipid droplets distinctly contributed to study of the proliferation,differentiation of adipocyte and analysis of the pathology on diseases.The drop method is very fast and efficient,and can significantly shorten the time of test and reduce reagent costs,thus making it widely used in scientific research and fast pathology diagnosis with adipose tissues.

adipose tissue; frozen sections; drop method; oil red O staining

2014-04-09，

2014-05-05

新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2011211A026)

王肖燕(1988-)，女，新疆乌鲁木齐人，在读硕士，主要从事肉品质质量与安全研究方向。E-mail：2462235994@qq.com

*[通讯作者]王金泉(1975-)，男，新疆乌鲁木齐人，副教授，硕士生导师，主要从事动物生长发育调控研究。 E-mail：wangjinquan163@163.com 姚 刚(1959-)，男，新疆乌鲁木齐人，教授，博士生导师，主要从事动物生理学方面研究。E-mail：yaogang516@163.com

S811.6

A

1005-5228(2014)08-0058-03