蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽的模拟胃肠道消化特性研究

陈佳捷，吴文惠，倪 玲，严 婷，赵清波，包 斌，3，*

(1.上海海洋大学食品学院，上海201306;2.上海海洋大学水产品加工与贮藏工程研究中心，海洋科学研究室，上海201306;3.上海海洋大学海洋科学研究室，上海201306)

昆虫(干重)的粗蛋白含量很高，而且昆虫蛋白被证明是必需氨基酸的优质来源，甚至更优于大豆蛋白［1］。来自昆虫的浓缩蛋白质甚至可以与浓缩酪蛋白相媲美［2］。一般的昆虫蛋白氨基酸的硫含量较低，但赖氨酸和苏氨酸含量较高，这两种氨基酸在谷物中可能是限制氨基酸。昆虫中通常脂肪含量丰富，同时也是维他命和矿物质的优质原料［3］。蚕蛹是缫丝产业一项很大的副产品，特别是在中国，每年的蚕蛹资源产量高达300000t，约占世界年产量的80%［4］。在中国、日本、韩国、印度和泰国等国家通常被用做饲料、动物食品、食品原料和传统药物等方面，特别是在中国，蚕蛹的使用历史悠久。然而目前由于缺乏合适高效的深加工技术，蚕蛹中丰富的蛋白质并没有得到充分的开发利用。蚕蛹的研究进展只在一些国家有有限的相似组成的数据，已发表的工作包括:B.mori L.［5－6］和 Antheraea pernyi 蚕蛹的化学组成［7－8］。近年，中国健康部门将蚕蛹列入“传统食品的新型食用性原料”，也深入的研究了蚕蛹的一些生物活性成分对人类健康的益处和应用潜力［9］。因此，本研究的目的是通过测定蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽在体外模拟胃肠道消化实验中的消化曲线和氮释放量，分析和评价其在动物饲料和人类肠内营养支持制剂方面的应用价值和发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蚕蛹蛋白和短肽 江苏南通福尔生物技术有限公司;胃蛋白酶 效价比1∶10000，美国 Sigma;胰蛋白酶 效价比1∶250，Genview;盐酸 优级纯;其他化学试剂均为分析纯或化学纯。

AB204－N型分析天平 Mettler Toledo仪器(上海)有限公司;DHG－9070A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;日立L－800型氨基酸分析仪 日立仪器(中国)有限公司;新苗HHS11－2－S型恒温水浴锅 上海新苗医疗器械制造有限公司;UV1102紫外可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司;SHA－C往复式水浴恒温振荡器 江苏省金坛市恒丰仪器制造有限公司;Kjeltel2300型全自动凯氏定氮仪 丹麦FOSS分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 所有的蚕蛹蛋白和短肽样品根据处理制备的方法不同分为三组，分别编号。根据朱新鹏等［10］介绍的碱法提取蚕蛹蛋白的工艺制得灰白色无味蛋白质粉末，编号为蚕蛹蛋白质样品1(SPPS1)。而根据邱英华等［11］双酶法水解蚕蛹蛋白的方法，由脱脂蚕蛹粉末通过双酶法(碱性蛋白酶和中性蛋白酶)水解得到了蚕蛹短肽样品2(SPPS2)和蚕蛹短肽样品3(SPPS3)。

1.2.2 氨基酸分析 准确称取蚕蛹样品粉末1g左右，置于100℃ 10mL的水解管中，再加入温度为100℃的7.5mol/L的优级纯盐酸4mL，于110℃的恒温干燥箱内水解24h，冷却至室温后用6mol/L的NaOH中和至中性，过滤后取滤液用去离子水定量到20mL作为样品液。取400μL样品液用0.02mol/L的优级纯盐酸稀释到2000μL，经过0.54μm的微孔滤膜过滤得到氨基酸分析用样品液，用氨基酸分析仪测定样品氨基酸组成。

酸性条件下，色氨酸会遭受极大的破坏，所以色氨酸的测定要采用碱水解的方法。准确称取蚕蛹蛋白样品粉末1g左右，置于15mL水解管加入6mL的碱水解液和0.5mL消泡剂(10%SDS)，置于水浴锅加热至100℃，于100℃的恒温干燥箱内水解20h，将水解液过滤，用6mol/L的盐酸中和至中性，加去离子水至30mL，作为色氨酸分析用样品液。使用紫外分光光度计分析色氨酸含量，以 pH7.0的0.2mol/L的Na2HPO4－NaH2PO4缓冲液配制色氨酸标准浓度溶液，以色氨酸标准浓度为横坐标，相应的荧光强度为纵坐标，作色氨酸标准曲线，计算得到色氨酸含量。

1.2.3 氨基酸评分(Amino acid score，AAS)，化学评分(chemical score，CS)和必需氨基酸指数(essential amino acid index，EAAI)评价食物蛋白质的营养价值，对于蛋白质品质的鉴定、新的食品资源的研究和开发、指导人群膳食等有重要意义。不同食品的蛋白质含量、氨基酸组成模式都不一样，人体对不同蛋白质的消化、吸收和利用程度也存在差异。评价蛋白质的方法有许多种，以FAO/WHO于1973年提出的氨基酸评分标准模式［12］和中国预防医学科学营养与食品卫生研究所提出的全鸡蛋蛋白模式［13］为依据进行比较，氨基酸评分(AAS)和化学评分(CS)按以下公式计算:

AAS=受试蛋白质中某种氨基酸的含量(mg/g蛋白质)/FAO/WHO评分模式下参考蛋白质中同种氨基酸的含量(mg/g蛋白质)

CS=受试蛋白质中某种氨基酸的含量(mg/g蛋白质)/参考蛋白质(全鸡蛋)中同种氨基酸的含量(mg/g蛋白质)

必需氨基酸指数(EAAI):利用 Penaflorida(1989)［14］评价斑节对虾饲料蛋白源时所采用的公式计算EAAI值。

式中:aa1，aa2，aa3，… aai－分别为实验蛋白质中的必需氨基酸比率(A/E)(指某种必需氨基酸占必需氨基酸总量的百分数);AA1，AA2，AA3，…AAi－分别为全鸡蛋蛋白质中的必需氨基酸比率;n－必需氨基酸个数，本实验中为8。

Oser(1959)［15］提出的利用 EAAI评价原料蛋白质的标准是:EAAI值大于0.90的为优质蛋白源，在0.80左右的为可用蛋白源，小于0.70的为不适宜蛋白源。在此基础上的新的评价标准，即EAAI≥0.90的为优质蛋白源，0.80≤EAAI＜0.90 的为良好蛋白源，0.70≤EAAI＜0.80 的为可用蛋白源，EAAI＜0.70的为不适蛋白源。

1.2.4 体外模拟胃肠消化特性 模拟胃肠液消化是根据人体胃肠消化液的主要成分及消化环境，在体外建立模拟胃肠消化体系。根据 Jovanì等［16］的方法，准确称取3g的样品悬浮于300mL pH2.5的HCl溶液(0.5mol/L)形成1%(W/V)或10g/L 的溶液，置于37℃水浴预热处理3～5min;然后以m酶∶m底物为1∶50加入胃蛋白酶，分别在不同消化时间(0、5、15、30、60、120min)取样，所取的样品用 1mol/L NaOH调节至pH7.0以中止消化反应;最终所得的消化液，经调节至pH7.0之后，加入一定量的胰蛋白酶，以 m 酶∶m 底物为 1∶50，再消化 0、5、15、30、60、120min，之后取样分析。分别取10mL的不同消化液于5000r/min离心10min后，取出上清液测定氨基酸组成。

1.2.5 氮释放量(%)的测定(TCA－ NSI 法)［17］10mL的不同消化液加入10mL的 10%TCA，于8000r/min离心30min后，倒出上清液。沉淀部分再用10mL的10%TCA洗涤，并于同样条件下离心，得到TCA不溶组分。蛋白质总氮和TCA不溶性氮含量采用凯氏定氮法测得。消化过程氮释放量(%)由下式计算而得:

其中，Nt为消化 t分钟时的 TCA不溶性氮(mg);No为SPI中的TCA不溶性氮(mg);Ntot为SPI的总氮量(mg)。

以上实验均重复测定三次，结果取平均值分析。

2 结果与分析

本研究中的蚕蛹蛋白样品SPPS1是灰白色、无味的均匀粉末，微溶于水;而蚕蛹短肽样品SPPS2和SPPS3是褐色，略有土腥味，易吸潮的均匀粉末，极易溶于水。在常温下蚕蛹蛋白比较稳定，不会发生生物化学性质的改变和生物活性的丧失，当作为肠内营养制剂的蛋白质来源时能够保证产品的特性和使用效果。

2.1 蚕蛹蛋白和短肽的氨基酸组成

三种样品的氨基酸组成分析结果如表1。

表1 蚕蛹蛋白和短肽样品的氨基酸组成(g/100g)Table 1 Amino acid composition(g/100g)of three silkworm pupae protein and peptide samples(g/100g)

以上结果为三次重复测定的平均值。

蚕蛹蛋白质是一种完全蛋白，含有常见的18种氨基酸(除SPPS3不含组氨酸)，含量都占蛋白质质量分数的70%左右。人体不能合成，必须由外界供给的必需氨基酸如蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸等在蚕蛹蛋白中含量均较高，总量在30%以上，根据表1的计算结果，必需氨基酸占总氨基酸的 45.00% 、42.45% 和 45.18% ，必需氨基酸与非必需氨基酸质量之比分别为0.82、0.74和0.82，都高于WHO/FAO(1973)提出的必需氨基酸占总氨基酸的40%左右，与必需氨基酸与非必需氨基酸之比为0.6左右的参考蛋白模式。与A.pernyi桑蚕相比较，虽然蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽总氨基酸中苏氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸含量较低，但一些重要氨基酸如甲硫氨酸和亮氨酸含量明显较高。样品之间氨基酸种类和含量的差别可能是由于采收季节的不同或制备处理技术的差别。蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽的氨基酸种类齐全，必需氨基酸含量成比例，符合FAO/WHO模式，是一种比较理想的优质蛋白质，而且蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽中呈味氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)占总氨基酸的含量分别是24.7%、23.8%、25.8%，甜味氨基酸(甘氨酸和丙氨酸)占总氨基酸的含量分别是 7.3% 、7.7% 和 7.7%。

2.2 蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽的AAS，CS和EAAI值分析

三种样品的AAS值计算结果列入表2，SPPS1中异亮氨酸、蛋氨酸+半胱氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、色氨酸以及缬氨酸含量均高于FAO/WHO的标准模式，亮氨酸含量与标准模式含量接近，赖氨酸和苏氨酸含量较低;SPPS2中蛋氨酸+半胱氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸以及缬氨酸含量均高于FAO/WHO的标准模式，色氨酸含量与标准模式含量接近，异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸含量较低;SPPS3中蛋氨酸+半胱氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸以及缬氨酸含量均高于FAO/WHO的标准模式，其他必需氨基酸均低于标准水平。结合表1中的氨基酸种类和含量分析，SPPS3中不含组氨酸，可能是由于两种蚕蛹原料的季节不同造成的。

三种样品的CS值和EAAI值列入表3。当以FAO/WHO的氨基酸评分标准模式(AAS)为参考量时，SPPS1的第一限制氨基酸为苏氨酸，第二限制氨基酸为赖氨酸;当以化学评分(CS)为参考标准时，SPPS1的第一限制氨基酸为赖氨酸，第二限制氨基酸为色氨酸和苏氨酸。当以FAO/WHO的氨基酸评分标准模式(AAS)为参考量时，SPPS2和SPPS3的第一限制氨基酸都为亮氨酸，第二限制氨基酸均为苏氨酸;当以化学评分(CS)为参考标准时，SPPS2的第一限制氨基酸仍为亮氨酸，第二限制氨基酸为色氨酸，SPPS3的第一限制氨基酸为亮氨酸和色氨酸，第二限制氨基酸为赖氨酸。

蛋白质的营养价值与氨基酸的组成有密切的联系，食物中最主要的限制氨基酸为赖氨酸和蛋氢酸。前者在谷物蛋白质和一些其它植物蛋白质中含量甚少;后者在大豆、花生、牛奶和肉类蛋白质中相对不足。通常，赖氨酸是谷类蛋白质的第一限制氨基酸。而蛋氢酸(含硫氨基酸)则是大多数非谷类植物蛋白质的第一限制氨基酸。两种评分模式下，三种样品中赖氨酸的含量都低于标准模式含量，而蛋氨酸的含量很显著的高于标准模式含量，如果将蚕蛹蛋白与非谷类植物蛋白例如豆类和肉类蛋白质配合食用，可调整各种必需氨基酸的比例，弥补此类食品中的蛋氨酸不足的缺憾，便于人体吸收，也能提高各种食物蛋白质的利用率。

表2 与FAO/WHO标准模式相比蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽的必需氨基酸组成(mg/g蛋白)Table 2 Essential amino acid compositions of silkworm pupae protein and peptide compared with the FAO/WHO pattern(mg/g蛋白)

表3 与全鸡蛋蛋白质相比蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽的必需氨基酸组成和品质评价Table 3 Essential amino acid compositions and material quality of silkworm pupae protein and peptide compared with the whole egg protein

三种蚕蛹蛋白粉的 EAAI均大于0.90，由此可见，蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽是优质的蛋白原料，能较好的满足人体需要。然而，若需将蚕蛹蛋白和短肽的EAAI值应用于动物或人类膳食营养补充的参考标准时，应该进行动物饲养实验和模拟消化实验，以进一步确定其应用范围和条件。

2.3 体外模拟胃/肠道消化特性和氮释放量曲线

模拟胃肠液消化是根据人体胃肠消化液的主要成分及消化环境，在体外建立模拟胃肠消化体系。蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽样品在37℃，0.5mol/L HCl溶液中，分别使用胃蛋白酶和胰蛋白酶分两阶段各消化2h，得到消化特性曲线如图1。

由图1可以看出，在前2h的胃蛋白酶消化阶段，SPPS2和SPPS3的必需氨基酸总数显著高于SPPS1，而进入胰蛋白酶消化阶段时，三者的必需氨基酸总数接近。

图1 体外模拟消化过程中蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽的必需氨基酸总数Fig.1 Amounts of the EAAs of three silkworm pupae protein and peptide samples during simulated gastrointestinal digestion in vitro

在整个体外模拟消化过程中(胃蛋白酶+胰蛋白酶)，三种样品的氮释放量变化如图2所示，在消化过程初期，两种蚕蛹短肽样品(SPPS2和SPPS3)的氮释放量上升很快且显著高于蚕蛹蛋白样品(SPPS1)，之后在胰蛋白酶消化阶段，三种样品的氮释放量趋势基本一致，且数据相近。三种样品在体外模拟消化中最终氮释放量均能达到90%左右，与天然大豆蛋白的体外模拟消化氮释放量(约75%)［18］相比，不仅消化速率较高，而且氮释放量也显著较高。

由图1和图2的结果可以表明:蚕蛹蛋白样品分子量本身就比较小，而蚕蛹短肽样品是由蛋白质水解得到的，三种样品经少量消化过程便可吸收甚至不需消化过程即可吸收。

图2 体外模拟消化过程中蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽的氮释放量Fig.2 The nitrogen release amount(%)of three silkworm pupae protein and peptide samples during simulated gastrointestinal digestion in vitro

3 结论与讨论

本研究中的蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽含有人体所必需的18种氨基酸，而且组成和含量优于FAO/WHO标准蛋白模式。若将蚕蛹蛋白与其他蛋白质配合食用，可调整各种必需氨基酸的比例，便于人体吸收和利用各种食物蛋白质。蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽在体外模拟胃肠消化过程中有高效的消化速率，氮释放量能达到90%左右。目前我国市场上常用的肠内营养(enteral nutrition，EN)制剂根据其化学结构及药理作用分为两大类:短肽型和整蛋白型，短肽型EN制剂是由蛋白质水解物为氮源所组成的要素膳(ED)，经少量消化过程便可吸收;整蛋白型EN制剂由整蛋白为氮源所组成的完全非要素膳(N－ED)，经消化过程方可吸收。所以蚕蛹蛋白具有优良高效的消化率，完全可以作为短肽型EN制剂的优质且经济的蛋白质原料。

目前的许多研究表明，蚕蛹蛋白有许多生理和药理学方面的活性，可以用作医药中间体［19］。三种蚕蛹蛋白和蚕蛹短肽样品(SPPS1，SPPS2，SPPS3)主要含有蛋白质、短肽和氨基酸，有报道表明蚕蛹能作用于四氯化碳诱导的肝损伤大鼠的肝脏，显著提高实验鼠的血红蛋白和血清总蛋白，产生对肝脏的保护作用［20］。蚕蛹的乙酸乙酯提取物主要包含:胆固醇、β－谷甾醇、β－蜕皮激素、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸等，而其中的胆固醇、β－谷甾醇、β－蜕皮激素具有类睾丸酮的作用［21］。蚕蛹水提物也能降低糖尿病小鼠的血糖而不影响正常小鼠的血糖［22］。

蚕蛹蛋白已经被认为是一个新型的高质量蛋白质原料，其包含人体所需的所有氨基酸，可以被用作膳食补充剂或食品添加剂［23－24］。如果能深入开发和合理利用这些蚕蛹蛋白质，从而充分利用丝绸工业的副产品，将会带来巨大的潜在的营养价值和经济利益。

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