亮氨酸调节大鼠胰岛素分泌的功能研究

童 星，董加毅，邬志薇，徐加英，秦立强，*

(1.苏州大学医学部实验中心，江苏苏州215123;2.苏州大学医学部公共卫生学院，江苏苏州215123;3.苏州大学医学部放射医学与防护学院，江苏苏州215123)

维持机体葡萄糖的稳态，需要胰岛素的精准调控。前期实验已发现乳清蛋白对胰岛素抵抗有改善作用［1］，且认为可能与乳清蛋白中富含亮氨酸(Leucine，Leu)有关。亮氨酸是人体必需的支链氨基酸，乳清蛋白中的亮氨酸比一般食物蛋白质高出50%～75%［2］，除了作为代谢底物参与蛋白质的从头合成外，对蛋白质、脂肪和碳水化合物三大营养素代谢也起到重要的调控作用［3－4］。近几年，亮氨酸的营养新功能备受关注。研究发现亮氨酸能改善肥胖、代谢综合症人群以及高脂诱导的肥胖大鼠的胰岛素抵抗和葡萄糖代谢，另外通过饮水给予小鼠较高浓度的亮氨酸，可增强其胰岛素的敏感性［5－6］。然而，也有报道称过量的亮氨酸通过抑制胰岛素早期功能的发挥而导致胰岛素抵抗［7－8］。因此，补充亮氨酸对机体胰岛素敏感性的影响尚无一致结论，这可能和亮氨酸给予量、时间以及研究对象所处的状况等有关［9－10］。目前我国关于亮氨酸对正常机体胰岛素调节作用的研究较少，亮氨酸在高危人群中能否起到预防作用还不得而知。因此，研究亮氨酸对正常机体的调节功能是十分有必要的。本研究通过体内和体外两个层面，观察了亮氨酸对离体胰岛细胞的胰岛素分泌的影响，并通过动物实验证实亮氨酸对正常大鼠胰岛素水平和糖耐量的作用，为探讨亮氨酸调节正常机体胰岛素分泌和糖代谢提供实验依据，同时也为亮氨酸预防糖尿病、代谢综合征等代谢性疾病提供理论依据。这对于进一步开发以氨基酸为基础的功能食品具有重要的现实意义。

表1 亮氨酸对低/高糖培养基培养的胰岛细胞分泌胰岛素的影响Table 1 Effect of leucine on insulin secretion of rat islet cells in DMEM containing low/high glucose

表2 各组大鼠血糖和胰岛素AUC的比较Table 2 Comparison of the AUC of plasma glucose and insulin in different groups

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

6周龄的雄性健康Wistar大鼠 购自中国科学院上海实验动物中心;亮氨酸和胶原酶Ⅴ Sigma公司;Hanks液和DMEM培养 GIBICO公司;血糖试纸 德国罗氏公司。

大鼠用胰岛素ELISA试剂盒 美国Millipore公司;活力型血糖仪 德国罗氏公司;酶标仪 美国BIO－TEK公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠胰岛细胞分离和亮氨酸刺激后的胰岛素测定 腹腔注射4%水合氯醛(1mL/100g)麻醉大鼠，腹正中线切口充分暴露胆总管，结扎胆总管十二指肠端，穿刺胆总管，缓慢注入预冷的0.5mg/mL胶原酶Ⅴ溶液8～10mL，使胰腺充分膨胀，迅速剪取胰腺，移入预置6mL Hanks液的培养瓶中，38℃水浴静止消化10min，振荡使其呈细砂状，加入4℃含10%胎牛血清的 Hanks液终止消化。不锈钢滤网(600μm)过滤后800r/min离心1min，弃上清，Hanks液洗涤离心2遍，收集沉淀。双硫腙染色判断胰腺细胞。将所收集到的胰岛细胞悬液在37℃、5%CO2培养箱中孵育60min，使胰岛细胞适应实验用培养基的改变。24孔培养板中分别加入 500μL低糖(5.6mmol/L)/高糖(25mmol/L)DMEM培养基，再加入200μL胰岛细胞悬液和不同浓度的亮氨酸(0、10、20mmol/L)，每组6个平行样。孵育120min后吸取上清用大鼠用胰岛素ELISA试剂盒测定胰岛素水平。该实验共进行了3次重复实验。

1.2.2 大鼠分组和亮氨酸灌胃后血糖和胰岛素水平的测定 将24只大鼠随机分为4组(n=6)，禁食过夜后分别用生理盐水(对照组，Con)、2g/kg葡萄糖(Glu组)、1.5g/kg亮氨酸(Leu组)、葡萄糖+亮氨酸(Glu+Leu组)灌胃。对照组的生理盐水灌胃量为1mL，葡萄糖和亮氨酸分别用蒸馏水配成50%和20%的浓度，Glu+Leu组是葡萄糖和亮氨酸同时溶于蒸馏水，达到灌胃所需量。于灌胃前(即空腹)、灌胃后30、60、120min割尾取血用血糖仪测定血糖，离心取血浆测定胰岛素水平，并计算血糖和胰岛素曲线下面积(AUC)。

1.3 统计学处理

所有数据用SPSS 16.0软件进行统计学处理，结果以平均值±标准差±s)表示。组间比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 亮氨酸对大鼠胰岛细胞胰岛素分泌的影响

低糖和高糖培养基中胰岛素水平无显著差异。低糖培养基中添加亮氨酸，胰岛素水平无明显变化。高糖培养基中添加亮氨酸后培养基中胰岛素水平升高，并呈剂量反应关系。和对照(不添加亮氨酸)比较，高糖培养基添加10mmol/L亮氨酸后胰岛素水平有上升趋势，但无显著性差异(p＞0.05)，添加20mmol/L亮氨酸则胰岛素显著升高(p＜0.05)(表1)。

2.2 亮氨酸对正常大鼠胰岛素和血糖水平的影响

大鼠灌胃后，Leu组大鼠血糖和胰岛素水平与Con组无明显差异。和Con组比较，Glu组的血糖显著升高(p＜0.01)，同时伴有胰岛素水平的上升(p＜0.05)。Glu+Leu组和Con组比较，血糖和胰岛素水平均显著升高(p＜0.01)。和Glu组比较，Glu+Leu组显著增加了30min时胰岛素的分泌(p＜0.01)(图1A);同时显著降低了60、120min的血糖(p＜0.05)(图1B)。和Con组比较，Leu组胰岛素AUC和血糖AUC均无明显变化;而Glu组和Glu+Leu组的胰岛素AUC及对应的血糖AUC显著增加(p＜0.01)。与Glu组比较，Glu+Leu组胰岛素AUC值显著增加(p＜0.01)，相应地血糖AUC值降低(p＜0.05)(表2)。

图1 亮氨酸对正常大鼠胰岛素(A)和血糖(B)水平的影响Fig.1 Effect of leucine on levels of insulin(A)and plasma glucose(B)in normal rats

3 结论与讨论

亮氨酸的营养新功能受到广泛关注，其中包括调节胰岛素分泌并影响胰岛素抵抗［4］。本研究中只有在高糖培养基中添加亮氨酸，离体的大鼠胰岛细胞悬液中胰岛素水平显著升高，提示在一定浓度葡萄糖下亮氨酸刺激胰岛素释放。Brouwer很早就观察到亮氨酸刺激胰岛素分泌的作用［11］，在和我们研究相同浓度(20mmol/L)亮氨酸刺激下，添加了22.2mmol/L葡萄糖的胰岛离体细胞中胰岛素分泌增加，而添加27.7mmol/L葡萄糖则降低了胰岛素分泌。我们的研究中，25mmol/L葡萄糖浓度介于两者之间(22.2～27.7mmol/L)，仍然发现胰岛素分泌的增加。亮氨酸刺激刺激离体胰岛分泌胰岛素所需的葡萄糖浓度存在一个范围，需要设计更多的浓度组加以观察。

在动物实验中，单独给予亮氨酸对血糖和胰岛素无影响，这和大鼠离体胰岛的研究结果一致。但是在摄取葡萄糖的同时给予亮氨酸，进一步升高了葡萄糖负荷后30min的胰岛素水平，并降低了60、120min的血糖水平。总的来说，通过表2实验结果可得出，同时给予葡萄糖和亮氨酸与单独摄取葡萄糖相比，其血浆胰岛素AUC增加27%，血糖AUC减少8%。Kalogeropoulou用健康成人作为观察对象得到相似的结果［12］，即单独摄入亮氨酸没有影响血清葡萄糖水平，当和葡萄糖一起摄取，2.5h血糖AUC降低了50%。因此，我们的离体和在体实验都证实了亮氨酸能够促进葡萄糖刺激的胰岛素释放，随之降低了葡萄糖负荷后的血糖水平。

亮氨酸主要通过以下两个途径促进胰岛素分泌。一是亮氨酸通过转氨作用形成α－酮异己酸，促进线粒体氧化;其次，亮氨酸通过自身氧化脱羧，变构激活谷氨酸脱氢酶为三磷酸循环提供原料。两者都最终促进胰岛素释放［3］。

本研究探讨了亮氨酸的急性效应，虽然一些研究发现亮氨酸摄取有利于控制肥胖，改善糖代谢和胰岛素抵抗［5－6］，但 Liu 等在小鼠离体胰岛细胞和INS－1E细胞加入亮氨酸72h后，葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损，导致胰岛β细胞的功能损伤［13］。Zanchi用地塞米松诱导大鼠胰岛素抵抗，在给予较高剂量的亮氨酸的情况，进一步增加了胰岛素抵抗，出现了糖尿病症状［9］。因此，亮氨酸作用于机体的长期效应还有待进一步研究。

综上所述，亮氨酸促进葡萄糖依赖的胰岛素的一过性释放，从而降低血糖水平。因此，要发挥亮氨酸调节胰岛素分泌的功能，通过摄取亮氨酸或者富含亮氨酸的蛋白质来刺激胰岛素释放时需要摄取一定量的碳水化合物，这也为亮氨酸的开发利用提供了一定的参考依据。

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