HPLC法测定连钱草中熊果酸和齐墩果酸的含量

邓向涛

HPLC法测定连钱草中熊果酸和齐墩果酸的含量

邓向涛

目的 建立高效液相色谱法(HPLC法)测定连钱草中熊果酸和齐墩果酸含量的方法。方法 依利特C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)为色谱柱, 甲醇- 0.05 M磷酸二氢钠溶液(87:13)为流动相, 流速1.0 ml/min, 检测波长210 nm。结果 熊果酸在0.55~5.45 μg范围内线性关系良好(r=0.9993), 平均回收率98.32%(RSD=1.74%)；齐墩果酸在0.22~2.19 μg范围内线性关系良好(r=0.9996), 平均回收率99.86%(RSD=1.84%)。结论 HPLC法简便准确, 可为连钱草的质量控制提供实验依据。

连钱草；熊果酸；齐墩果酸；高效液相色谱法

连钱草为唇形科植物活血丹的干燥地上部分, 具有利湿通淋、清热解毒、散瘀消肿的功效。对于连钱草的质量控制,《中华人民共和国药典》(2010年版)主要通过木犀草素的薄层色谱来鉴别真伪, 通过测定醇溶性浸出物的含量来控制药材质量, 并未见具体化学成分的含量测定。三萜酸类为连钱草主要有效成分, 其中熊果酸具有抑制血管生成、抗肿瘤、抗炎等作用；齐墩果酸具有保肝、消炎、降糖等作用。本文以熊果酸和齐墩果酸为指标, 采用高效液相色谱法同时测定二者的含量, 为该药材的质量控制提供实验依据。

1 仪器与试剂

岛津LC-10A型高效液相色谱仪。熊果酸对照品(含量测定用, 批号：110742-200212), 齐墩果酸对照品(含量测定用, 批号：110709-200505), 均购自中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯, 水为纯化水, 其他试剂均为分析纯。连钱草药材来源于河南、湖北、江苏等地, 经鉴定均为唇形科植物活血丹的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 熊果酸、齐墩果酸对照品干燥至恒重, 分别精密称取5.45 mg、2.19 mg, 置于10 ml容量瓶中,加入无水乙醇溶解并稀释至刻度, 摇匀即得。对照品溶液中熊果酸浓度为0.545 mg/ml, 齐墩果酸浓度为0.219 mg/ml。

2.1.2 供试品溶液的制备 取连钱草样品约2.0 g, 置于平底烧瓶中, 加入甲醇25 ml密塞称重, 加热回流提取30 min放冷,称定后以甲醇补足减失的重量, 摇匀后滤过, 弃去初滤液,取续滤液12.5 ml蒸干, 残渣加无水乙醇-氯仿(3:2)混合液溶解并定容至10 ml量瓶中, 摇匀, 微孔滤膜(0.45 μm)过滤,滤液作为供试品溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱：大连依利特C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：甲醇- 0.05 m磷酸二氢钠溶液(87:13)；流速：1.0 ml/min；检测波长210 nm。理论塔板数以熊果酸和齐墩果酸峰计均不低于4000。

2.3 线性关系考察 准确吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10 μl, 分别注入高效液相色谱仪, 以色谱峰面积(μV·s)为纵坐标(Y轴), 以进样量(μg)为横坐标(X轴), 进行线性拟合并绘制标准曲线。熊果酸的回归线性方程为Y=366131 X-9288 r=0.9993；齐墩果酸的回归线性方程为Y=428589 X-50454, r=0.9996。结果表明：熊果酸进样量在0.55~5.45 μg, 齐墩果酸进样量在0.22~2.19 μg范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验 准确吸取对照品溶液8 μl, 重复进样测定5次, 计算各峰面积的RSD。熊果酸峰面积的RSD为1.92%,齐墩果酸峰面积的RSD为2.51%, 结果表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 准确吸取供试品溶液15 μl, 分别于0、3、6、9、12 h进样, 计算各峰面积的RSD。熊果酸峰面积的RSD为1.74%；齐墩果酸峰面积的RSD为2.13%, 结果表明所测组分在12 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验 取同一批连钱草样品, 共5份, 制备供试品溶液, 进样测定, 外标法计算熊果酸和齐墩果酸的含量,结果二者的RSD分别为2.09%和2.60%, 表明样品制备方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验 取同一批已知含量连钱草样品, 共6份, 每份约1.0 g, 分别加入适量的对照品, 制备供试品溶液, 测定含量并计算回收率。结果熊果酸的平均加样回收率为98.32%, RSD为1.74%；齐墩果酸的平均加样回收率为99.86%, RSD为1.84%。

2.8 样品含量测定 取不同产地连钱草样品, 制备供试品溶液, 分别精密吸取对照品溶液4 μl、样品溶液15 μl, 注入高效液相色谱仪, 外标法计算熊果酸和齐墩果酸的含量。结果见表1。

表1 连钱草样品熊果酸和齐墩果酸含量测定结果

3 讨论

同一产地连钱草样品中, 熊果酸的含量远高于齐墩果酸；不同产地连钱草中, 熊果酸和齐墩果酸的含量存在较大差异, 同一省份含量略接近。结果表明连钱草药材的质量与生长环境、栽培方法、采集时间及存放时间等因素关系密切。

2014-06-25］

450003 郑州大学附属肿瘤医院