L型钙通道β2亚基在心房颤动中的表达变化

蒙滋滋 钟国强 涂荣会 何 艳 黎庆捷 李 烁

L型钙通道β2亚基在心房颤动中的表达变化

蒙滋滋 钟国强 涂荣会 何 艳 黎庆捷 李 烁

目的 研究L型钙通道β2亚基在心房颤动中的表达变化。方法 收集42例行风湿性心脏病瓣膜置换术患者右心房组织作为标本, 其中慢性心房颤动患者22例, 窦性心律患者20例, 分别作为慢性心房颤动组和窦性心律组。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测L型钙通道β2亚基的mRNA表达, 以及用Western Blot方法检测L型钙通道β2亚基的蛋白表达。结果 与窦性心律组比较, 慢性心房颤动组中L型钙通道β2亚基在mRNA及蛋白水平的表达则均较窦性心律组显著上调(P＜0.05)。结论 慢性心房颤动组心房组织中L型钙通道β2亚基的表达上调, 从而影响心房颤动的发生和维持。

L型钙通道β2亚基；心房颤动；右心房组织

心房颤动(房颤)是临床上最常见的心律失常之一, 目前房颤的作用机制尚不清楚。因此, 积极寻找新的靶点对临床房颤的防治十分重要。L型钙通道β2亚基(CACNB2)在人心肌中表达［1］, 并对房颤的发生有着密切联系［2］, 但是目前关于CACNB2的研究较少, 本文就CACNB2在心房颤动中的mRNA及蛋白水平的表达进行研究, 探讨其表达变化在房颤中的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择于2012年8月~2013年5月在广西医科大学第一附属医院心胸外科住院行风湿性心脏病瓣膜置换术的患者42例, 其中房颤患者22例(房颤病史>6个月), 窦性心律(窦律)患者20例, 分别作为慢性房颤(CAF)组和正常窦律(NSR)组。所选病例年龄、性别、手术方式并无统计学差异。病例选择排除标准：①口服钙离子拮抗剂患者；②有感染性心内膜炎；③临床上有风湿性活动征象；④年龄>55岁或<18岁。⑤患有糖尿病, 严重肝肾疾病、系统性红斑狼疮等疾病。

1.2 标本采集和保存 所选病例于体外循环建立时取约100 mg右心房组织放入无RNA酶的冻存管中并迅速置于液氮中保存。

1.3 主要试剂 Trizol(invitrogen), 逆转录试剂盒(Fermantas#k 1622), 一抗(Santa Cruz, sc-81890), 二抗(北京中彬金桥, ZB-2305), 内参抗体(上海康成生物公司, KC-5G5)。

1.4 实验方法

1.4.1 qRT-PCR检测 ①取约50 mg右心房组织加入Trizol试剂中匀浆提取总RNA, 并将提取好的RNA溶解于DEPC水中, 于紫外分光光度仪测定浓度和OD值, 所有样本总RNA的OD值均在1.8~2.0范围内。将总RNA按Fermantas逆转录试剂盒#k1622说明书进行逆转录合成cDNA。②引物由上海生工生物有限公司代为设计合成CACNB2 Forward primer:5'-ATGCGAGCAGGACGTCGA-3',CACNB2 Reverse primer:5'-TTAGAGCGGCTCCACTTGG-3';β-actin Forward primer:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3';β-actin Reverse primer:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。③qRT-PCR检测：使用SYBR Green 1染料法进行相对定量。qRT-PCR使用仪器为美国AB7500实时荧光定量PCR仪。CACNB2及β-actin反应条件：95°变性10 min, 95°变性15 s, 58°退火45 s, 72°延伸30 s, 共40个循环, 72°延伸10 min。④根据目的和内参所得的Ct值, 用内参做标准化处理, 计算2-△△ct值以进行相对定量, 计算所得值用相对于窦律组表达的倍数来表示。

1.4.2 Western Blot检测 ①取约50 mg右心房组织放入RIPA裂解液中, 并加入蛋白酶抑制剂后进行匀浆。提取总蛋白后, 用BCA试剂盒测定蛋白浓度。②取等量蛋白上样进行电泳(10%分离胶, 5%浓缩胶), 用0.45 mmPVDF膜进行转膜, 5%TBST牛奶封闭, 目的一抗及内参GAPDH孵育过夜, 二抗孵育1 h。③为了校正上样量及曝光时间造成的差异,显影时采用GAPDH作为内参, 每个条带均同时检测GAPDH的表达量。各条带CACNB2的相对表达量为CACNB2灰度值/GAPDH的灰度值。

2 结果

2.1 CACNB2的qRT-PCR结果 组间CACNB2的比较,慢性房颤组较正常窦律组明显上调［(1.9783±0.3231)VS (0.7215±0.4021), P＜0.05］, 差异有统计学意义。

2.2 CACNB2的Western Blot结果 经过软件获取条带的灰度值, 计算目的条带与内参条带GAPDH的灰度值之比, 进行相对半定量分析, CACNB2在房颤组中蛋白表达显著高于正常窦律组［(1.35±0.20)VS(1.07±0.23), P＜0.05］。结果如图1所示, 差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 心房颤动 (RAF) 组与窦性心律 (RSR) 组蛋白表达的对比

3 讨论

心房颤动是常见的心律失常之一, 目前发病机制尚未清楚。近年研究表明, 心房颤动与心房肌的有效不应期缩短有关［3］, 主要为动作电位2期平台期的缩短, 而此期ICaL作为与钾离子通道电流拮抗的电流［4］, 在心房颤动中起重要作用。风湿性因素对于L型钙通道的表达无直接影响 。Yue等在房颤犬模型的研究中提出IcaL降低［5］, 此后亦有不少文献作相关报道。对慢性房颤的研究中, 目前钙超载是房颤的发生和维持的主要机制之一, 是电重构的重要环节［6］。L型钙通道在钙电流变化中起重要作用。L型钙通道β亚基有四种亚型, 只有β2亚基在心肌表达［1］。本研究通过RT-PCR和Western Blot可知, 房颤组mRNA及蛋白表达高于窦律组,即CACNB2表达发生了上调, 此结果与Schotten的报道相似。Schotten等［7］研究发现持续性房颤患者心肌L型钙通道β2a亚基的表达并不下调, 所以, 房颤时IcaL降低可能与其他亚基或者亚型的下调或表达异常有关。本实验研究的是慢性房颤患者右心耳组织中L型钙通道β2亚基的表达, 而在既往的研究中鲜有相关报道。

CACNB2表达发生上调, 可使L型钙通道活性增强, 加速L型钙通道激活, 增加钙电流,促使细胞内Ca2+浓度迅速增高, 发生了钙超载, 导致L型钙通道本身加速失活, IcaL降低, 有效不应期缩短, 促进房颤的发生［8］。而L型钙通道的失活不仅与膜电位有关, 还与细胞内钙浓度相关［9］, 房颤时快速心房率会进一步加剧细胞内钙超载, 引起细胞内L型钙通道其他亚基和其他钙通道的表达和功能的改变, 进而维持房颤的发生［5］。

［1］ Bodi I, Mikala G, Koch SE, et al.The L-type calcium channel in the heart：the beat goes on.Clin InVest, 2005(115):3306-3317.

［2］ Antzelevitch C, Pollevick GD, Cordeiro JM,et al.Loss-of-function mutations in the cardiac calcium channel underlie a new clinical entity characterized by ST-segment elevation, short QT intervals, and sudden cardiac death.Circulation, 2007,115(4):442-449.

［3］ Wijffels MC, Kirchhof CJ, Dorland R, et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats.Circulation, 1995(92):1954-1968.

［4］ Van Wagoner DR, Pond AL, Lamorgese M, et al.Atrial L-type Ca2+ currents and human atrial fibrillation.Circ Res, 1999,85(5):428-436.

［5］ Shi YQ, Yang C, Ding WJ, et al.Changes of the mRNA and protein expression of α1 subunit of L-type and T-type calcium channels in human atrial myocardlum of rheumatic atrial fibrillation patients.Molecular Cardiology of China, 2011,10(1):11-16.

［6］ Allessie M, Ausma J, Schotten U.Electrical, contractile and structural remodeling during atrial fibrillation.Cardiovasc Res, 2002, 54(2):230-246.

［7］ Schotten U, Haase H, Frechen D, et al.The L-type Ca2+ channel subunits alphalC and beta2 are not downregulated in atrial myocardium of patients with chronic atrial fibrillation.Jmol Cardiol, 2003, 35(5):437-443.

［8］ Findlay I.Physiological modulation of inactivation in L-type Ca2+ channels: one switch.J Physiol, 2004,554(2):275-283.

［9］ De Leon M,Wang Y, Jones L, et al.Essential Ca(2+)-binding motif for Ca(2+)-sensitive inactivation of L-type Ca2+ channels.Sciense, 1995, 270(5241):1502-1506.

Changes of the expression of L-type calcium channel β2subunit in human atrial myocardium of atrial fibrillation patient.

MENG Zizi, ZHONG Guoqiang, TU Ronghui, et al.Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical, University, Nanning 530021, China

Objective To investigate Changes of the expression of L-type calcium channel β2subunit(CACNB2) in atrial fibrillation (AF).Methods The right atrial tissue was collected from Rheumatic heart valve replacement patients, and the number of the patient were 22 for Chronic AF, 20 for normal Sinus rhythm(NSR).Respectively, Real-time quantative PCR(qRT-PCR)was used to examine the expression of mRNA of CACNB2, and Western Blot was used to examine the expression of protein of CACNB2.Results Compared with NSR group, the expression of mRNA and protein of CACNB2 were significantly up-regulated (P＜0.05) in AF group.Conclusion The occurrence of AF may associate with changes of theexpression of CACNB2 which plays an important role in atrial fibrillation.

L-type calcium channelβ2subunit; Atrial fibrillation; Right atrial tissue

广西自然科学基金项目(项目编号：桂财教201319 号)

530021 南宁, 广西医科大学第一附属医院老年心内科

钟国强 E-mail：gq_zhong@yahoo.com