髓系白血病患者骨髓单个核细胞β—连环蛋白mRNA的表达

张巧玲+杨永强

[摘要] 目的 观察急慢性髓系白血病患者骨髓单个核细胞β-连环蛋白的表达及其意义。 方法 41例髓系白血病患者，其中25例急性髓系白血病（AML），16例慢性髓系白血病（CML）。同时选择18例非恶性血液病患者作为对照。肝素抗凝骨髓2 ml，Ficoll液分离骨髓单个核细胞，荧光定量逆转录聚合酶链反应法检测β-连环蛋白的表达。 结果 β-连环蛋白在AML组表达量明显高于CML组及对照组（P<0.01）；CML组表达量高于对照组表达量，差异有统计学意义（P<0.05）；CML组4例急变患者的β-连环蛋白表达量也较高。β-连环蛋白表达量与患者年龄、性别无关；与骨髓原始细胞含量有关，含量≥30%的患者β-连环蛋白表达量较高。 结论 β-连环蛋白在AML和CML急变的患者骨髓单个核细胞中异常高表达，Wnt/β-连环蛋白通路在AML和CML急变病例中异常激活可能与白血病细胞的异常增殖有关。

[关键词] 髓系白血病；骨髓单个核细胞；β-连环蛋白

[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（b）-0004-04

髓系白血病（myeloid leukemia，ML）是造血系统恶性克隆性疾病，分为急性髓系性白血病（acute myeloid leukemia，AML）及慢性髓系性白血病（chronic myeloid leukemia，CML）。多种癌基因、抑癌基因及其相关基因、凋亡调节基因的功能异常可导致细胞分化受阻滞，恶性增殖时机体对细胞免疫监视失常，两方面共同奠定了ML的发病基础。许多细胞内信号转导分子和基因转录调节因子在ML发病机制中的作用越来越受到重视。β-连环蛋白（β-catenin）是近年来发现的一种信号传导分子，具有参与细胞黏附和介导Wnt信号转导的双重功能，并与肿瘤的发生发展及浸润转移密切相关[1-2]，其在ML发病机制中的作用是目前研究的热点之一[3-4]。β-连环蛋白分子在胞质中的异常积累是关键环节，而蛋白水平的增高涉及其合成的增多与降解的减少，Wnt通路主要在蛋白降解水平上对β-连环蛋白进行调节，而对于β-连环蛋白转录水平的研究国内外报道较少。本研究应用实时定量PCR的方法，从mRNA水平研究了β-连环蛋白在 ML中表达的差异，以探讨ML患者Wnt信号途径下游核转录因子β-连环蛋白与ML预后治疗的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

实验组：2011年5月～2013年5月佛山市三水区人民医院收治门诊和住院的AML及CML患者共41例，其中初治23例，复发18例；包括AML 25例，CML 16例；男性18例，女性23例；年龄15～79岁，中位年龄39岁。所有患者均经细胞形态学、组织化学和细胞免疫学检查，符合ML的诊断指标。

对照组18例，为骨髓涂片大致正常的非恶性血液病患者，其中男性8例，女性10例，年龄19～66岁，中位年龄31岁。

1.2 主要仪器及试剂

C1000 Thermal cycler PCR仪（Bio-Rad公司）、ABI 7300荧光定量仪、Scanspeed 1730R低温离心机（Labogene 公司），荧光定量PCR试剂、Oligod（T）Primer、Random Primer、DEPC.H2O皆为TaKaRa公司产品。

引物探针设计合成：GenBank上查找目的基因mRNA序列，应用Primer Express 2.0 软件，在CDS区设计特异性引物，序列如下：H-b-cat（扩增片段长度98 bp）正向引物：5′-TGATGGTCTGCCAAGTGGGT-3′；反向引物：5′-AAGAGCACAGATGGCAGGCT-3′。H-β-actin（扩增片段长度为106 bp）：正向引物：5′-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3′；反向引物：5′-TC-GTCCCAGTTGGTGACGAT-3′。合成引物探针公司为Invitrogen公司，合成仪器为ABI 3900台式高通量DNA合成仪。

1.3 实验方法

1.3.1 单个核细胞分离 治疗前采集患者骨髓2 ml，经肝素抗凝，Ficoll-hypaque密度梯度离心分离单个核细胞（MNC），PBS洗涤后计数，-80℃保存备用。

1.3.2 全血总RNA的提取 250 μl骨髓单个核细胞液（约5×107个单核细胞）加入1.5 ml离心管中，加入800 μl Trizol振荡15 s，再加入200 μl氯仿，振荡15 s，室温静置5 min；4℃ 12 000 r/min，离心15 min。取上清液依次用酚氯仿、异丙醇提取，75%乙醇（DEPC水配制）洗涤，加DEPC处理水溶解RNA，-80℃保存备用。

1.3.3 去基因组及总RNA纯度检测 使用RNase-free的DNase Ⅰ（Promega），按以下体系配置100 μl反应液：RNA 20 μl、DNase Ⅰ 20 μl、10×Buffer 10 μl、RNase Inhibitor 0.5 μl、H2O（RNase free）49.5 μl；37℃消化30 min，65℃灭活10 min。然后依次经等体积的苯酚、氯仿、异丙醇常规处理，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗涤2次，超净台风干；加入15～40 μl DEPC水溶解沉淀。纯度检测：取1 μl RNA样品50倍稀释，在岛津（日本）UV-1750紫外分光光度仪上测定OD值，OD260/OD280在1.8～2.0，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。

1.3.4 逆转录反应 取4 μl RNA模板做逆转录反应，仪器为Bio-Rad定性PCR仪（美国），20 μl反应体系如下：5×PrimeScriptTM Buffer （for real time）2 μl、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μl、Oligo dT Primer（50 μmol/L） 1 μl、Random 6 mers（100 μmol/L）2 μl、RNA模板4 μl、无RNA酶水10 μl。反应条件37℃ 15 min，然后85℃ 5 s。

1.3.5 荧光定量PCR反应 待测样本按以下反应体系进行：10×PCR缓冲液2.5 μl、dNTPs 0.5 μl、Taq 酶0.5 μl、上下引物（10 pmol/μl）各0.5 μl、cDNA 2 μl、H2O 18.5 μl。反应条件为：93℃预变性2 min，然后93℃变性15 s，55℃ 25 s，72℃ 25 s，共40个循环。

1.4 统计学处理

相对定量法-CT值的定量方法（CT值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数）：①ΔCT=CT目的基因-CT内参基因；②ΔΔCT=ΔCT-ΔCT最大值；③样本的相对表达量=2-ΔΔCT

各组间的比较采用SPSS 16.0统计软件包中非参数统计中成组设计的t检验（双侧t检验），以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-连环蛋白样本扩增的结果

β-连环蛋白样本扩增的结果间图1、2。图1的扩增曲线反映扩增效果良好，图2的溶解曲线显示锐利的单一峰，说明试验设计的反应条件合适，扩增产物均一，无非特异扩增。

2.2 β-连环蛋白在髓细胞白血病中的表达

β-连环蛋白在急慢性髓系白血病中均有不同程度的表达（表1），在AML组表达量明显高于CML组及对照组（P<0.01），5例M4患者β-连环蛋白表达均>23，最高的为M3病例，达到65.649；CML组表达量高于对照组表达量，差异有统计学意义（P<0.05），CML组4例急变患者的β-连环蛋白表达量也较高，分别为19.88、18.24、15.436、17.712。

2.3 β-连环蛋白基因表达与AML临床特征的关系

AML骨髓β-连环蛋白表达量与患者的男女性别之间的差异无统计学意义，在年龄≥60岁或<60岁的表达无关系；在骨髓原始细胞含量>30%的患者组中AML骨髓β-连环蛋白平均表达量高于原始细胞小于30%的患者组，差异有统计学意义（表2）。

3 讨论

Wnts蛋白是一类富含半胱氨酸残基的分泌性糖蛋白家族，Wnt与细胞表面受体卷曲蛋白和低密度脂蛋白受体相关蛋白家族相结合，启动Wnt通路[5]。在正常和非增殖细胞中缺乏Wnt信号，大部分β-连环蛋白与上皮钙黏蛋白一起连接在细胞膜上，小部分游离的β-连环蛋白也被磷酸化而失活[6]。核内因为没有Wnt信号传入，DNA转录受到抑制，细胞增殖水平正常。异常情况下，Wnt信号或其他胞外信号刺激导致β-连环蛋白不能被磷酸化灭活，β-连环蛋白转位到胞核中，与转录因子TCF/LEF结合转变为转录激活剂，特异地启动下游靶基因如c-myc、c-myb、cyclinD1、ETS等的转录和表达，引起细胞增殖加快，抵抗凋亡[7]。β-连环蛋白在白血病细胞恶性增殖中的作用也不断被证实[8]。

本研究结果显示，在急性髓系白血病中β-连环蛋白普遍异常高表达，在CML急变患者中表达同样异常增高，而在自身免疫性溶血性贫血、血小板减少症等良性血液病中呈低表达；β-连环蛋白表达与患者的年龄、性别关系不大，与原始细胞的数量多少关系密切，提示Wnt/β-连环蛋白信号通路可能在白血病细胞异常激活，与白血病细胞的恶性增殖有关。王韫秀等[9]的研究结果显示，在AML的各亚型中M1、M2、M4、M5及M6中β-连环蛋白呈高表达，而M3中表达量较低；这与本研究结果中M3亚型同样高表达有所区别。

近年来关于Wnt/β-连环蛋白通路在急慢性白血病中的研究逐渐增多[10]，王焱等[11]通过55例AL患者研究推测Wnt抑制因子1（WIF-1）基因启动子甲基化及β-连环蛋白过表达参与了AL患者Wnt/β-连环蛋白途径的异常激活；有报道显示，Wnt/β-连环蛋白通路在CML干细胞中通过调控ABCB1基因参与了多重耐药作用[12]。Wnt/β-连环蛋白通路的作用使得其在白血病治疗领域的研究也备受重视[13]，Wang等[14]研究认为，β-连环蛋白和蛋白激酶B（ATK）抑制剂可作为联合治疗AML的分子靶向药物。有研究认为，不同的肿瘤细胞对于抑制Wnt/β-连环蛋白通路的反应不同，可能导致并不是所有的AML患者都适用于此项定向治疗[15]。本研究结果推测Wnt/β-连环蛋白通路在AML和CML急变患者中异常激活，可能与白血病细胞的异常增殖有关；而β-连环蛋白表达量与不同亚型的AL的预后关系如何以及抑制β-连环蛋白水平对于AL的治疗是否有效，都值得进一步探讨研究。

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（收稿日期：2014-05-03 本文编辑：林利利）

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（收稿日期：2014-05-03 本文编辑：林利利）