RP—HPLC法测定湘西藤茶二氢杨梅素的含量

付明　李胜华　张婷等

摘要：采用索氏提取法、乙醇浸提法、超声波-乙醇法提取藤茶中二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY），RP-HPLC法测定其含量。结果表明，超声波-乙醇法提取率最高，采用Sino chrome C18柱，以甲醇-0.1%磷酸（体积比27 ∶73）为流动相，检测波长为294 nm时，线性关系良好（r=0.999 2），平均加样回收率为97.8%，RSD=0.69%；重现性试验RSD为0.33%，说明该方法准确、可信度高。湘西藤茶DMY含量在5月底达到最高，叶中约25.43%，茎中约6.22%，因此其最佳采摘时期为5月底。

关键词：藤茶；最佳采摘期；超声波-乙醇法；二氢杨梅素（DMY）；RP-HPLC

中图分类号： R284.1；O657.7+2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0332-03

收稿日期：2013-09-15

基金项目：湖南省科技计划（编号：2013FJ6090）；湖南省高校科技创新团队支持计划（编号：2010212）；湖南省“十二五”植物学重点建设学科项目（编号：201142）。

作者简介：付明（1966—），女，湖北荆门人，副教授，主要从事植物生物化学研究。E-mail：fm6988@163.com。藤茶别称显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），属葡萄科蛇葡萄属。湘西少数民族将其制成保健茶，长年饮用可强身健体，还可治疗感冒、咽喉肿痛、黄疸型肝炎等症[1]。藤茶有抗氧化作用[2-3]，含有大量黄酮类物质，其中主要是二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）。有研究表明，藤茶叶中总黄酮含量达45%[4-5]，DMY含量达16.32%～33.03%[6]，这是非常罕见的，吸引了许多学者开展相关研究。黄酮物质可抑制脂质过氧化[7]、抑菌[8]、降血压、降血糖[9-10]、减轻肝细胞变性和肿胀[11]、增强单核巨噬细胞吞噬功能和溶血功能、抗肿瘤、祛痰止咳等。随着研究的深入，DMY降血糖、抗氧化、抑菌、抗肿瘤等活性成为研究热点。本研究以湘西藤茶为原料，从索氏提取法、乙醇浸提法、超声波-乙醇法中选择DMY提取率最高的方法提取样品DMY，再用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法对不同时期、不同部位DMY含量进行测定，确定湘西藤茶的最佳采摘时期，为其合理开发提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

藤茶采自湖南省怀化市。DMY对照品（纯度99%，湖南省张家界至诚生物有限公司）；甲醇、磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司），均为色谱纯。

Waters 1525高效液相色谱仪（美国Waters公司）；JY98-IIDN 智能型超声波细胞粉碎机（浙江省宁波新芝生物科技股份有限公司）；FW177型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1样品溶液的制备将材料洗净、切段、干燥后粉碎并过60目筛，密封保存。

索氏提取法：取样品2.0 g置于索氏提取器中，回流提取8 h，收集滤液，旋转蒸发浓缩后用65%乙醇定容至100 mL。取150 μL稀释后用0.45 μm滤膜过滤制成相当于原料 0.3 mg/mL 的样品液1。

乙醇浸提法：取样品2.0 g置于三角瓶中，加入65%乙醇，65 ℃下振荡提取24 h，5 000 r/min离心，收集滤液，用65%乙醇定容至100 mL。同上处理得样品液2。

超声波-乙醇提取法：取样品2.0 g加入40 mL 65%乙醇，于65 ℃温水中浸提2 h；用超声波处理20 min，离心；滤渣再用40 mL 65%乙醇超声25 min，离心；合并滤液，用65%乙醇定容至100 mL。同上处理得样品液3。

1.2.2色谱条件的选择选择色谱柱系Sino chrom C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；进样体积 20 μL；柱温31 ℃；流动相为甲醇-水，分别用磷酸、磷酸二氢钠调节pH值，以不同的比例分别在294、310 nm波长处进样，根据峰形确定最佳的色谱条件。

1.2.3标准曲线及线性关系考察取干燥后的DMY粉末0.010 6 g，用甲醇溶解、定容至10 mL，配成1.06 mg/mL的DMY对照品液。分别取DMY对照品溶液0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.6、1.9 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成不同浓度的对照品溶液。吸取各浓度对照品溶液20 μL，注入色谱仪，按确定的色谱条件测峰面积，以峰面积对DMY浓度绘制标准曲线。

2结果与分析

2.1色谱条件的确定

当采用甲醇-水为流动相时，出现拖尾；加入磷酸二氢钠时，拖尾现象稍有改善但分离效果不太好；加入磷酸时，消除了拖尾现象，峰形对称，分离效果好。将甲醇-0.1%磷酸按（20～80） ∶（20～80）进样，当甲醇、0.1%磷酸体积比27 ∶73时，对照品和样品的各组分达到了良好的分离，且保留时间适中。当检测波长为294 nm时，DMY的峰无杂质干扰。因此，确定最佳色谱条件为Sino chrom C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱温31 ℃，检测波长294 nm；流动相为甲醇-0.1%磷酸（27 ∶73），流速1.0 mL/min；进样体积 20 μL。按照该色谱条件将对照品和样品液分别进样，RP-HPLC 图谱分别见图1、图2，DMY保留时间约为 7.5 min。

2.2标准曲线及回归方程的建立

以峰面积对对照品浓度绘制标准曲线，得回归方程y=60 055.848 5x-73 641.974 2，r=0.999 2，说明在4.24～8056 g/mL范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。endprint

2.3二氢杨梅素提取方法的确定

将样品液1、样品液2、样品液3分别在确定的色谱条件下进样，平均峰面积分别为2 631 664、2 975 265、3 087 388 μV·s，样品液3的峰面积最大，说明超声波-乙醇法的提取效率最高，故采用超声波-乙醇法提取藤茶DMY。

2.4精密度和稳定性试验

取同一份对照品溶液重复进样5次，记录DMY的峰面积（表1），计算RSD为1.6%。

2.6样品中二氢杨梅素含量的测定

藤茶茎、叶中DMY含量在5月底达到最高，叶中含量约25.43%，茎中约6.22%，之后DMY含量逐渐降低。4—9月的藤茶茎、叶的DMY含量如图3所示。

测定DMY含量的方法有分光光度法、比值-导数荧光法、HPLC法等。何桂霞等用乙醇回流法提取显齿蛇葡萄中DMY，用Novapak-C18 柱于25 ℃、290 nm检测，叶中DMY含量最高达31.25%，茎中最高达9.2%[12]。范世明等以乙腈-0.1%磷酸（8 ∶92）为流动相，用HPLC法测得闽产显齿蛇葡萄叶中DMY含量为33.03%，茎中为4.49%[6]。结果的差异可能是由材料来源、提取方法、采用的柱、流动相、柱温等不同造成的，也说明该植物在不同地区因地理、气候、海拔等因素不同，DMY含量在不同季节有很大区别。本试验选择甲醇作流动相，是因为甲醇经济实惠，并且毒性较乙腈小；重现性试验的RSD为0.33%，表明结果可信度高。

3结论

本研究比较了3种提取方法，结果表明超声波-乙醇法提取样品DMY的时间最短、提取率最高，该法可以作为提取黄酮、DMY的通用方法。

RP-HPLC法具有快速省时、简便，方法灵敏、精密度高等特点，适合于藤茶DMY含量的测定。本研究测得湘西藤茶不同时期叶中DMY含量为11.21%～25.43%，茎中为30%～6.22%；在5月底采摘湘西藤茶，可使藤茶得到充分利用，保健价值高。

参考文献：

[1]熊璞，姚茂君，肖凯军. 藤茶中二氢杨梅素的提取工艺研究[J]. 现代食品科技，2009，25（8）：907-910.

[2]Wang Y F，Ying L，Sun D，et al. Supercritical carbon dioxide extraction of bioactive compounds from Ampelopsis grossedentata stems：process optimization and antioxidant activity[J]. International Journal of Molecular Sciences，2011，12（10）：6856-6870.

[3]Wang Y F，Bian X Y，Park J，et al. Physicochemical properties，in vitro antioxidant activities and inhibitory potential against α-glucosidase of polysaccharides from Ampelopsis grossedentata leaves and stems[J]. Molecules，2011，16（9）：7762-7772.

[4]覃洁萍，梁山丹，何翠薇. 差示分光光度法测定广西瑶族藤茶中黄酮类成分的含量[J]. 中草药，2002，33（7）：607-609.

[5]付明，胡朝暾，周亮，等. 藤茶黄酮含量及其体外抗脂质过氧化能力研究[J]. 食品工业科技，2013，34（7）：146-148，214.

[6]范世明，梁一池，王河山. HPLC法测定闽产显齿蛇葡萄中二氢杨梅素的含量[J]. 福建中医药大学学报，2012，22（1）：46-47.

[7]徐静娟，姚茂君，邬敏辰. 二氢杨梅素生物功效的研究[J]. 食品科学，2008，29（11）：622-625.

[8]萧力争，郭维，刘素纯，等. 茶叶提取物与二氢杨梅素抑菌活性比较研究[J]. 安徽农业大学学报，2008，35（2）：239-242.

[9]Dong H Q，Li M，Zhu F，et al. Inhibitory potential of trilobatin from Lithocarpus polystachyus Rehd against α-glucosidase and α-amylase linked to type 2 diabetes[J]. Food Chemistry，2012，130（2）：261-266.

[10]Kumar S，Narwal S，Kumar D，et al. Evaluation of antihyperglycemic and antioxidant activities of Saraca asoca（Roxb.）De wild leaves in streptozotocin induced diabetic mice[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Disease，2012，2（3）：170-176.

[11]郑成，丘雅茹，招燕红，等. 藤茶中二氢杨梅素的中试规模微波提取及降血糖作用研究[J]. 广州大学学报：自然科学版，2007，6（6）：26-31.

[12]何桂霞，裴刚，杨伟丽，等. HPLC测定藤茶不同采收时期及不同部位的二氢杨酶素含量[J]. 中成药，2004，26（3）：40-42.endprint

2.3二氢杨梅素提取方法的确定

将样品液1、样品液2、样品液3分别在确定的色谱条件下进样，平均峰面积分别为2 631 664、2 975 265、3 087 388 μV·s，样品液3的峰面积最大，说明超声波-乙醇法的提取效率最高，故采用超声波-乙醇法提取藤茶DMY。

2.4精密度和稳定性试验

取同一份对照品溶液重复进样5次，记录DMY的峰面积（表1），计算RSD为1.6%。

2.6样品中二氢杨梅素含量的测定

藤茶茎、叶中DMY含量在5月底达到最高，叶中含量约25.43%，茎中约6.22%，之后DMY含量逐渐降低。4—9月的藤茶茎、叶的DMY含量如图3所示。

测定DMY含量的方法有分光光度法、比值-导数荧光法、HPLC法等。何桂霞等用乙醇回流法提取显齿蛇葡萄中DMY，用Novapak-C18 柱于25 ℃、290 nm检测，叶中DMY含量最高达31.25%，茎中最高达9.2%[12]。范世明等以乙腈-0.1%磷酸（8 ∶92）为流动相，用HPLC法测得闽产显齿蛇葡萄叶中DMY含量为33.03%，茎中为4.49%[6]。结果的差异可能是由材料来源、提取方法、采用的柱、流动相、柱温等不同造成的，也说明该植物在不同地区因地理、气候、海拔等因素不同，DMY含量在不同季节有很大区别。本试验选择甲醇作流动相，是因为甲醇经济实惠，并且毒性较乙腈小；重现性试验的RSD为0.33%，表明结果可信度高。

3结论

本研究比较了3种提取方法，结果表明超声波-乙醇法提取样品DMY的时间最短、提取率最高，该法可以作为提取黄酮、DMY的通用方法。

RP-HPLC法具有快速省时、简便，方法灵敏、精密度高等特点，适合于藤茶DMY含量的测定。本研究测得湘西藤茶不同时期叶中DMY含量为11.21%～25.43%，茎中为30%～6.22%；在5月底采摘湘西藤茶，可使藤茶得到充分利用，保健价值高。

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[4]覃洁萍，梁山丹，何翠薇. 差示分光光度法测定广西瑶族藤茶中黄酮类成分的含量[J]. 中草药，2002，33（7）：607-609.

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[6]范世明，梁一池，王河山. HPLC法测定闽产显齿蛇葡萄中二氢杨梅素的含量[J]. 福建中医药大学学报，2012，22（1）：46-47.

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[12]何桂霞，裴刚，杨伟丽，等. HPLC测定藤茶不同采收时期及不同部位的二氢杨酶素含量[J]. 中成药，2004，26（3）：40-42.endprint

2.3二氢杨梅素提取方法的确定

将样品液1、样品液2、样品液3分别在确定的色谱条件下进样，平均峰面积分别为2 631 664、2 975 265、3 087 388 μV·s，样品液3的峰面积最大，说明超声波-乙醇法的提取效率最高，故采用超声波-乙醇法提取藤茶DMY。

2.4精密度和稳定性试验

取同一份对照品溶液重复进样5次，记录DMY的峰面积（表1），计算RSD为1.6%。

2.6样品中二氢杨梅素含量的测定

藤茶茎、叶中DMY含量在5月底达到最高，叶中含量约25.43%，茎中约6.22%，之后DMY含量逐渐降低。4—9月的藤茶茎、叶的DMY含量如图3所示。

测定DMY含量的方法有分光光度法、比值-导数荧光法、HPLC法等。何桂霞等用乙醇回流法提取显齿蛇葡萄中DMY，用Novapak-C18 柱于25 ℃、290 nm检测，叶中DMY含量最高达31.25%，茎中最高达9.2%[12]。范世明等以乙腈-0.1%磷酸（8 ∶92）为流动相，用HPLC法测得闽产显齿蛇葡萄叶中DMY含量为33.03%，茎中为4.49%[6]。结果的差异可能是由材料来源、提取方法、采用的柱、流动相、柱温等不同造成的，也说明该植物在不同地区因地理、气候、海拔等因素不同，DMY含量在不同季节有很大区别。本试验选择甲醇作流动相，是因为甲醇经济实惠，并且毒性较乙腈小；重现性试验的RSD为0.33%，表明结果可信度高。

3结论

本研究比较了3种提取方法，结果表明超声波-乙醇法提取样品DMY的时间最短、提取率最高，该法可以作为提取黄酮、DMY的通用方法。

RP-HPLC法具有快速省时、简便，方法灵敏、精密度高等特点，适合于藤茶DMY含量的测定。本研究测得湘西藤茶不同时期叶中DMY含量为11.21%～25.43%，茎中为30%～6.22%；在5月底采摘湘西藤茶，可使藤茶得到充分利用，保健价值高。

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[8]萧力争，郭维，刘素纯，等. 茶叶提取物与二氢杨梅素抑菌活性比较研究[J]. 安徽农业大学学报，2008，35（2）：239-242.

[9]Dong H Q，Li M，Zhu F，et al. Inhibitory potential of trilobatin from Lithocarpus polystachyus Rehd against α-glucosidase and α-amylase linked to type 2 diabetes[J]. Food Chemistry，2012，130（2）：261-266.

[10]Kumar S，Narwal S，Kumar D，et al. Evaluation of antihyperglycemic and antioxidant activities of Saraca asoca（Roxb.）De wild leaves in streptozotocin induced diabetic mice[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Disease，2012，2（3）：170-176.

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[12]何桂霞，裴刚，杨伟丽，等. HPLC测定藤茶不同采收时期及不同部位的二氢杨酶素含量[J]. 中成药，2004，26（3）：40-42.endprint