蛇莓RAPD与ISSR—PCR反应体系优化

张聪子　童巧珍　郭婷等

摘要：采用单因素试验结合正交试验，对PCR反应体系中的5种主要反应因子Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度进行优化筛选，确立了适合蛇莓基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系，RAPD反应体系（20 μL）：Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250 μmol/L、Taq酶1 U、引物0.2 μmol/L、DNA模板60 ng；ISSR反应体系（20 μL）：Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 250 μmol/L、Taq酶0.5 U、引物1 μmol/L、DNA模板60 ng。利用确立的体系对24份蛇莓种质进行扩增，结果条带清晰明亮，多态性好。

关键词：蛇莓；RAPD-PCR；ISSR-PCR；单因素；正交设计；体系优化

中图分类号： S567.201 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0050-04

收稿日期：2013-11-06

基金项目：湖南省教育厅项目（编号：10C1029）。

作者简介：张聪子（1987—），男，湖北咸宁人，硕士研究生，从事中药资源研究。

通信作者：童巧珍，博士，副教授，硕士研究生导师，从事中药质量与资源研究。E-mail：qztong88@126.com。 蛇莓[Duchesnea indica（Andr.）Focke]为蔷薇科蛇莓属植物，为民间常用草药，具有清热解毒、消肿散瘀，收敛止血、凉血之功效[1-2]。长期以来，科研工作者对蛇莓开展了大量研究，近年来，因发现蛇莓具有抗肿瘤活性而更加引起学者们的关注，蛇莓已成为一种开发前途广阔的植物资源。目前，对蛇莓的研究主要集中在栽培及药理等领域，分子方面的研究相对较少。本试验以蛇莓为研究对象，选择对PCR扩增体系稳定性影响较大的5个因素，包括模板DNA、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物浓度进行优化，以期确立稳定适合于蛇莓的 ISSR 及RAPD分子标记的PCR反应体系，为蛇莓的资源鉴定与遗传多样性研究提供技术依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1蛇莓种质材料取自湖南中医药大学药植园人工栽培的蛇莓新鲜幼嫩叶片，24组样本均保存于-70 ℃冰箱中。1-24号分别为邵阳隆回1号、邵阳隆回2号、邵阳隆回3号、邵阳隆回4号、邵东、常德1号、常德2号、常德澧县、大围山1号、大围山2号、平江冬塔、平江幕阜山、平江石浆、平江石浆阜西、衡山、永顺西岐、浏阳周洛、株洲、娄底、长沙植物园、长沙市含浦1号、长沙市含浦2号、长沙望城、长沙县。

1.1.2试剂所用试剂均购于北京鼎国生物公司。RAPD-PCR体系优化选用随机引物P8，序列为5′-：TCTGGTGAGG-3′；ISSR-PCR体系优化选用引物GRD205 824，序列为 5′-（TC）8A-3′。

1.2基因组DNA提取

蛇莓植物基因组DNA采用试剂盒（北京天根）提取，用核酸蛋白测定仪和l%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。将DNA稀释成20 ng/μL，贮存于-20 ℃冰箱备用。

1.3PCR扩增及凝胶电泳

ISSR扩增程序[3]为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃再延伸 10 min，4 ℃保存。

RAPD扩增程序[4]为94 ℃预变性5min；94 ℃变性 1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，40个循环；72 ℃再延伸 5 min，4 ℃保存。

PCR产物均用含有溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶在 0.5×TBE 中电泳，点样10 μL，电压4 V/cm，电泳结束后在凝胶成像系统上检测拍照。

1.4PCR反应体系的优化

针对20 μL反应体系中的5个主要因素Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度，设定4个水平，分别建立单因素及正交设计表（表1、表2），确立RAPD和 ISSR-PCR 反应体系。

1.5退火温度的优化

以上述反应体系优化确定的5个因素的最佳浓度水平为基础，对退火温度进行优化。将RAPD退火温度范围设置为30～45 ℃，由梯度PCR仪随机生成12个梯度，分别为30.0、303、31.5、33.0、34.8、36.6、38.4、40.2、42.0、43.5、44.6、45.0℃。

ISSR退火温度设置为45.0～61.5 ℃，由梯度PCR仪随机生成12个退火温度。分别为45.0、45.2、46.1、47.5、49.3、514、53.6、55.8、57.8、59.6、60.8、61.5℃。

1.6ISSR-PCR和RAPD-PCR反应体系的验证

利用上述已建立的ISSR及RAPD反应体系，用RAPD随机引物P99：5′-GTCCTGGGTT-3′和ISSR引物GRD205835：5′-（TG）8G-3′，对24份蛇莓材料DNA进行PCR扩增，对已确立的RAPD和ISSR反应体系进行验证。

2结果与分析

2.1单因素试验

3讨论

当前，仅有姚旭丽等采用单因素试验对蛇莓ISSR-PCR反应体系的主要反应因子进行了优化[5]，但尚未开展ISSR和RAPD分子标记对蛇莓种质资源的研究，由于该方法并没有考察因素间的相互作用，物种不同反应体系条件也有较大的变化[6]。本试验选择单因素结合正交试验设计对影响蛇莓RAPD和ISSR反应体系的各个因子进行优化，期望得到最佳的PCR反应体系。

PCR对模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶要求不高，一般来说，只要提供足够的模板量（<1 000 ng），1.0～1.5 U（20 μL体系）都会得到稳定的条带；但2者浓度过高不仅浪费还会导致非特异性扩增产物积累[7]。

PCR反应条件中影响最大的是Mg2+、dNTPs与引物的浓度[7]，在RAPD-PCR各因素浓度水平互相作用中，高Mg2+、低dNTPs浓度，以及低Mg2+、高dNTPs浓度条件不能扩增出条带或产生极弱的条带，因为dNTPs过早被消耗完，使产物单链化，甚至得不到产物；而过量的dNTPs对Mg2+的螯合作用明显，从而降低了依赖于Mg2+的TaqDNA聚合酶的活性，也不能扩增出条带[8-10]；而在ISSR-PCR中，Mg2+浓度太低时，不管引物和dNTPs浓度如何，均不能成功扩增，表明了Mg2+在扩增中的重要性。

碱基长度决定了引物的退火温度，RAPD中随机引物大多为10个碱基，退火温度一般为36 ℃，过低会导致引物与模板非特异性结合，引起扩增的特异性下降[11-12]；但过高，如大于 40 ℃ 时会抑制反应，导致无片段。ISSR引物大多数为 15～20个碱基长度，比随机引物多，适合较高的退火温度，并且能提高ISSR-PCR反应的特异性及精确度。

参考文献：

[1]江苏新医学院. 中药大辞典：下册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1985：211.

[2]彭江南，陆蕴如，陈德昌. 蛇莓化学成分的研究[J]. 中草药，1995，26（7）：339-341.

[3]刘婷. 芥菜种质资源遗传多样性的RAPD和ISSR分析[D]. 重庆：西南大学，2009.

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[12]宋贤勇，柳李旺，龚义勤，等. 萝卜基因组DNA RAPD与 ISSR-PCR 反应体系优化[J]. 种子，2007（2）：1-5.

PCR反应条件中影响最大的是Mg2+、dNTPs与引物的浓度[7]，在RAPD-PCR各因素浓度水平互相作用中，高Mg2+、低dNTPs浓度，以及低Mg2+、高dNTPs浓度条件不能扩增出条带或产生极弱的条带，因为dNTPs过早被消耗完，使产物单链化，甚至得不到产物；而过量的dNTPs对Mg2+的螯合作用明显，从而降低了依赖于Mg2+的TaqDNA聚合酶的活性，也不能扩增出条带[8-10]；而在ISSR-PCR中，Mg2+浓度太低时，不管引物和dNTPs浓度如何，均不能成功扩增，表明了Mg2+在扩增中的重要性。

碱基长度决定了引物的退火温度，RAPD中随机引物大多为10个碱基，退火温度一般为36 ℃，过低会导致引物与模板非特异性结合，引起扩增的特异性下降[11-12]；但过高，如大于 40 ℃ 时会抑制反应，导致无片段。ISSR引物大多数为 15～20个碱基长度，比随机引物多，适合较高的退火温度，并且能提高ISSR-PCR反应的特异性及精确度。

参考文献：

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PCR反应条件中影响最大的是Mg2+、dNTPs与引物的浓度[7]，在RAPD-PCR各因素浓度水平互相作用中，高Mg2+、低dNTPs浓度，以及低Mg2+、高dNTPs浓度条件不能扩增出条带或产生极弱的条带，因为dNTPs过早被消耗完，使产物单链化，甚至得不到产物；而过量的dNTPs对Mg2+的螯合作用明显，从而降低了依赖于Mg2+的TaqDNA聚合酶的活性，也不能扩增出条带[8-10]；而在ISSR-PCR中，Mg2+浓度太低时，不管引物和dNTPs浓度如何，均不能成功扩增，表明了Mg2+在扩增中的重要性。

碱基长度决定了引物的退火温度，RAPD中随机引物大多为10个碱基，退火温度一般为36 ℃，过低会导致引物与模板非特异性结合，引起扩增的特异性下降[11-12]；但过高，如大于 40 ℃ 时会抑制反应，导致无片段。ISSR引物大多数为 15～20个碱基长度，比随机引物多，适合较高的退火温度，并且能提高ISSR-PCR反应的特异性及精确度。

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[11]李盛清，张传博，乙引，等. 石斛ISSR-PCR体系的优化[J]. 江苏农业科学，2012，40（8）：37-39.

[12]宋贤勇，柳李旺，龚义勤，等. 萝卜基因组DNA RAPD与 ISSR-PCR 反应体系优化[J]. 种子，2007（2）：1-5.