沉默Fas和PKCδ表达对游离脂肪酸诱导的HUVEC凋亡的影响

蔡 威，周 逸，杨 锴，陈曼华，杨飞燕

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院心内科 武汉 430014

沉默Fas和PKCδ表达对游离脂肪酸诱导的HUVEC凋亡的影响

蔡 威，周 逸，杨 锴，陈曼华，杨飞燕#

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院心内科 武汉 430014

#通讯作者，女，1976年4月生，博士，副主任医师，研究方向：冠心病发病机制，E-mail:feiyanyang@hotmail.com

PKCδ；Fas；游离脂肪酸；人脐静脉内皮细胞；凋亡；siRNA

目的：探讨Fas与PKCδ在游离脂肪酸(FFA)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡中的作用。方法①取对数生长期HUVEC，分为空白组，对照组，50、75、100 μmol/L FFA组及相应FFA+PKCδ siRNA转染组，采用比色法检测细胞增殖情况，Western blot检测p-PKCδ蛋白的表达。②将HUVEC分为空白组，对照组，FFA组(100 μmol/L FFA处理)和FFA+PKCδ siRNA组，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。③取100 μmol/L FFA干预后的HUVEC分别转染无关序列siRNA和Fas siRNA, 以未转染细胞作空白对照，Western blot法检测p-PKCδ和Fas蛋白的表达。结果①各组细胞增殖水平差异有统计学意义(F=20.863，P<0.001)，FFA可抑制细胞增殖(P<0.05)，而PKCδ siRNA能减弱FFA对细胞增殖的抑制(P<0.05)。各组细胞p-PKCδ蛋白的表达差异有统计学意义(F=229.072，P<0.001)，FFA能提高p-PKCδ蛋白的表达水平(P<0.05),而PKCδ siRNA可抑制FFA引起p-PKCδ蛋白的表达(P<0.05)。②各组细胞凋亡率差异有统计学意义(F=86.973，P<0.001)，FFA可增加细胞凋亡(P<0.05)，而PKCδ siRNA能降低FFA所致的凋亡(P<0.05)。③各组细胞Fas蛋白表达差异有统计学意义(F=122.162，P<0.001)，Fas siRNA可减低HUVECFas蛋白的表达(P<0.05)。结论FFA诱导的HUVEC凋亡可能由PKCδ涉及的Fas通路介导。

游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)在内皮细胞损伤所致的心脑血管疾病进展中扮演重要角色[1-3]。PKCδ已经被确定是多种细胞功能的关键介质，包括细胞增殖和凋亡[4-5]。PKCδ可诱导多种细胞凋亡，包括嗜中性粒细胞、角质形成细胞、神经元细胞、成纤维细胞、转化细胞和心肌细胞[6]。前期报道[7-8]发现，PKCδ与Fas介导的凋亡有协同作用。该研究应用FFA药物干预人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelium cell,HUVEC)，并应用RNA干扰技术在FFA干预条件下抑制PKCδ的表达，观察沉默PKCδ的表达对FFA干预的HUVEC增殖和凋亡的影响；同时，应用RNA干扰技术沉默Fas蛋白，检测Fas和PKCδ蛋白在FFA干预的HUVEC中的变化，旨在探讨PKCδ和Fas与凋亡有关的相互作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1细胞和试剂HUVEC购自武汉大学生物保存中心。DMEM高糖培养基、转染用无血清Opti-MEMI培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。FFA购自美国Sigma公司。Trizol和Transfection Reagent Lipofectamine 2000 购自美国 Invitrogen公司。cDNA 第一链合成试剂盒为加拿大 Fermentas公司产品。FAST SYBR购自美国ABI公司。应用 Primer Premier 5.0软件设计PCR引物序列，交上海生工生物工程公司合成。WST-1购自日本同仁化学公司。PKCδ siRNA、Fas siRNA、p-PKCδ、Fas和β-actin购自美国Santa Cruz公司。流式细胞学检测试剂盒购自武汉启动子生物公司。2.5 g/L胰蛋白酶，IP及WB蛋白提取液，BCA蛋白定量试剂盒和ECL发光试剂盒均购自江苏碧云天公司。

1.2细胞培养HUVEC培养于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，取对数生长期细胞用于实验。FFA按文献[9]报道的描述制备。HUVEC转染前1 d，换用不含抗生素的新鲜培养基后，调整HUVEC密度为2×105mL-1，以每孔2 mL接种于6 孔板中培养过夜。

1.3荧光定量PCR检测待细胞达到50%～70%融合时，分为3组：空白组，无关序列siRNA转染组(对照组)和PKCδ siRNA转染组，每组设3个复孔。按照Lipofectamine 2000说明书，使用无血清Opti-MEMI培养基进行细胞转染，转染4～6 h后用含有体积分数10%血清的DMEM高糖培养基，转染48 h。应用Trizol裂解液提取细胞的总RNA，将1 μg的RNA逆转录成cDNA。荧光定量PCR反应体系为10 μL: 5 μL Fast SYBR, 3 μL灭菌去离子水, 1 μL cDNA模板和各0.5 μL的上、下游引物。目的基因mRNA的相对表达量=2-ΔCt,ΔCt=(Ct目的基因-Ctβ-actin)。

1.4细胞增殖能力的检测取对数生长期HUVEC接种于96孔板，根据FFA药物干预和PKCδ siRNA的转染分为空白组，BSA对照(对照)组，50、75、100 μmol/L FFA组、50、75、100 μmol/L FFA+ PKCδ siRNA组，每组设3个复孔。FFA组分别给予相应浓度FFA处理，PKCδ siRNA转染组在不同浓度FFA处理后待细胞融合达60%～70%后转染PKCδ siRNA。依据 WST-1说明书，采用比色法测定细胞活力。每孔加入2 μL WST-1试剂, 37 ℃孵育2 h，在490 nm分光光度计检测。

1.5细胞凋亡的检测采用同样的细胞培养法和转染方法，将HUVEC分为空白组，BSA对照(对照)组，FFA组和FFA+PKCδ siRNA组，每组设3个复孔，FFA组细胞加入100 μmol/L FFA，FFA+PKCδ siRNA组细胞加入100 μmol/L FFA后转染PKCδ siRNA。收集干预后的细胞，PBS洗涤3遍，用100 μL预冷的Binding缓冲液重悬细胞，加入5 μL FITC标记的Annexin V和5 μL PI混匀避光孵育15 min，再加入400 μL Binding缓冲液混匀后，上流式细胞仪检测。计算细胞的凋亡率。

1.6细胞中p-PKCδ和Fas蛋白的Westernblot检测将100 μmol/L FFA干预的HUVEC按以上方法接种于6孔板，分别转染无关序列siRNA(对照组)和Fas siRNA,以未转染的细胞作空白对照，每组设3个复孔。待转染48 h后提取细胞蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度， Western blot 法检测目的蛋白p-PKCδ和Fas表达量，一抗稀释1 000倍，二抗稀释5 000倍，使用ECL显影液，曝光、显影。同法检测1.4实验分组细胞中p-PKCδ蛋白的表达。利用Image J灰度分析软件分析，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.7统计学处理采用SPSS 11.0进行数据分析。各组细胞PKCδ mRNA表达、细胞增殖、细胞凋亡率以及Fas和p-PKCδ蛋白表达的比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组细胞PKCδmRNA的表达见表1。

表1 各组细胞PKCδ mRNA的表达

F=36.839,P<0.001；*：与空白组和对照组比较，P<0.05。

2.2各组细胞增殖的水平见表2。FFA抑制了HUVEC的增殖，以100 μmol/L效果最明显。转染PKCδ siRNA后，FFA对细胞增殖的抑制能力减弱。

2.3各组细胞中p-PKCδ蛋白的表达见图1和表2，加入FFA后，p-PKCδ蛋白的表达水平明显增加，而在FFA干预的HUVEC中加入PKCδ siRNA后，p-PKCδ蛋白的表达水平明显降低。

图1 各组细胞中p-PKCδ蛋白的表达

1：空白组；2：对照组；3：50 μmol/L FFA组；4：75 μmol/L FFA组；5：100 μmol/L FFA组；6：50 μmol/L FFA+PKCδ siRNA组；7：75 μmol/L FFA+PKCδ siRNA组；8：100 μmol/L FFA+PKCδ siRNA组。

表2 各组细胞增殖能力和p-PKCδ蛋白的表达

*：与空白组和对照组比较，P<0.05；#：与各浓度FFA组比较，P<0.05。

2.4各组细胞凋亡的变化见表3。HUVEC加入FFA后，细胞凋亡率明显增加，而在FFA干预的HUVEC中加入PKCδ siRNA后，细胞凋亡率降低。

表3 各组细胞凋亡率的比较 %

F=86.973,P<0.001;*：与空白组和对照组比较，P<0.05；#：与100 μmol/L FFA组比较，P<0.05。

2.5 3组细胞Fas蛋白和p-PKCδ蛋白表达的比较见图2和表4。

图2 3组细胞中Fas和p-PKCδ蛋白的表达

表4 3组细胞中Fas和p-PKCδ蛋白的表达

*：与空白对照组和对照组比较，P<0.05。

FFA干预后的HUVEC转染Fas siRNA后，Fas蛋白的表达水平明显降低，而p-PKCδ蛋白的表达水平无明显改变。

3 讨论

FFA诱导的内皮细胞凋亡已有相关报道。Li等[2]发现参与胰岛素信号通路的Akt通路在HUVEC中可被高浓度的FFA抑制，进而导致凋亡。此外，目前的研究[10]已证实PKCδ活性与糖尿病相关的病理性血管新生及视网膜外膜细胞凋亡等密切相关。另外，研究[6]还发现FFA可以激活内皮细胞PKCδ的表达，且PKC家族积极参与了代谢及心血管疾病的发生发展过程[11]。该研究中，作者观察到FFA干预可以降低HUVEC的增殖，但这种效应可通过转染PKCδ siRNA沉默PKCδ表达逆转。与此同时，作者还发现FFA诱导的凋亡可以被PKCδ siRNA转染阻断。以上结果提示PKCδ在FFA所致的内皮细胞功能失调中可能发挥着至关重要的调节作用。

凋亡过程中经常可以观察到Fas-FasL信号通路的激活。研究[12-14]发现Fas-FasL信号通路在动脉粥样硬化及糖尿病的内皮细胞功能受损中常常呈激活状态，提示Fas-FasL信号通路可能参与了内皮细胞损伤及凋亡过程。然而极少有PKCδ与Fas-FasL信号通路在内皮细胞中潜在关系的研究。该研究中，FFA干预HUVEC可增加PKCδ激酶活性相关的p-PKCδ蛋白的表达；而Fas siRNA处理细胞后，在抑制Fas表达的同时，也抑制了FFA诱导的p-PKCδ蛋白的表达。以上结果提示Fas可能是FFA诱导的凋亡信号通路中PKCδ的下游信号分子，FFA引起的HUVEC凋亡可能由PKCδ诱导的Fas表达所介导，进而激活Fas-FasL信号通路，导致内皮细胞的损伤与凋亡。

综上所述，PKCδ介导的FFA诱导的HUVEC增殖、凋亡可能是通过下游Fas信号实现的。在此基础上，研究PKCδ和Fas与内皮细胞损伤的关系，将有助于进一步阐明FFA所致心脑血管疾病的分子机制，从而为心脑血管疾病的干预提供新的分子生物学靶点。

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(2013-11-05收稿 责任编辑李沛寰)

Role of PKCδ and Fas in free fatty acid-induced HUVEC cell apoptosis

CAIWei,ZHOUYi,YANGKai,CHENManhua,YANGFeiyan

DepartmentofCardiology,theCentralHospitalofWuhan,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430014

PKCδ；Fas；free fatty acid；human umbilical vein endothelium cell；apoptosis；siRNA

Aim: To investigate the effect of PKCδ and Fas on free fatty acid-induced apoptosis in human umbilical vein endothelium cell(HUVEC). Methods: PKCδ siRNA was transfected into HUVEC, and RT-PCR was used to detect the expression of PKCδ mRNA.HUVEC cells were treated with blank， control, 50,75,100 μmol/L FFA and the corresponding PKCδ siRNA transfected groups.FFA groups were treated with 50, 75 and 100 μmol/L FFA, and PKCδ siRNA transfected groups were transfected with PKCδ siRNA after treatment with different concentrations of FFA. Colorimetric assay was used to determine cell proliferation, and Western blot was used to investigate the protein expression of p-PKCδ. HUVEC cells were classified into four groups: blank, control, FFA and FFA+PKCδ siRNA group. FFA group was treated with 100 μmol/L FFA, and FFA+ PKCδ siRNA group was transfected with PKCδ siRNA after treated with 100 μmol/L FFA. Flow cytometry was used to measure the apoptosis rate of the four groups. 100 μmol/L FFA treated HUVEC cells were transfected with unrelated sequence siRNA and Fas siRNA,the FFA treated HUVEC cells without siRNA transfection was used as the control. Western blot was used to investigate the protein expression of p-PKCδ and Fas. Results: The mRNA expression of PKCδ was decreased in cells transfected with PKCδ siRNA (F=36.839,P<0.001).Significant statistical difference was observed in cell proliferation between groups (F=20.863，P<0.001). FFA could significantly inhibit the proliferation of HUVEC cells (P<0.05), whereas PKCδ siRNA decreased the effect of FFA in HUVEC cells (P<0.05). Significant statistical difference was observed in protein expression of p-PKCδ between groups (F=229.072,P<0.001). FFA could upregulate the protein expression of p-PKCδ (P<0.05), while PKCδ siRNA could abolish this effect (P<0.05). Significant statistical difference was observed in cell apoptosis between groups (F=86.973，P<0.001). FFA could increase cell apoptosis (P<0.05), while PKCδ siRNA could abolish FFA induced apoptosis (P<0.05). Significant statistical difference was observed in protein expression of Fas between groups (F=122.162,P<0.001). Fas siRNA could significantly downregulate the protein expression of Fas in HUVEC cells (P<0.05). Conclusion: FFA-induced apoptosis in HUVEC cells may possibly mediate by PKCδ and involve in the upregulation of its downstream Fas.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.012

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