霉酚酸酯对糖尿病肾病大鼠肾组织TLR4、IL-18表达的影响

申鹏霄，王建生，赵瑛瑛

郑州大学第二附属医院肾内科 郑州 450014

霉酚酸酯对糖尿病肾病大鼠肾组织TLR4、IL-18表达的影响

申鹏霄，王建生#，赵瑛瑛

郑州大学第二附属医院肾内科 郑州 450014

#通讯作者，女，1957 年 11 月生，硕士，教授，研究方向:肾小球疾病，E-mail:wjs9857@sina.com

糖尿病肾病；霉酚酸酯；TLR4；IL-18；大鼠

目的：探讨霉酚酸酯对糖尿病肾病大鼠肾脏Toll样受体-4(TLR4)及白细胞介素-18(IL-18)表达的影响。方法雄性SD大鼠随机分为对照组(n=12)、模型组(n=11)、治疗组(n=11)，后2组制作糖尿病肾病模型。治疗组每天给予霉酚酸酯15 mg/kg灌胃，余2组给予溶媒灌胃。于12周末采用HE染色、PAS染色观察肾脏病理改变，免疫组化、Western blot检测肾组织TLR4、IL-18蛋白的表达。结果与对照组比较，模型组大鼠肾小球体积增大，基底膜增厚，炎症细胞浸润明显，而治疗组较模型组有所改善。3 组大鼠肾组织TLR4、IL-18蛋白的表达差异有统计学意义，其中模型组大鼠肾组织TLR4、IL-18蛋白的表达均高于对照组(P<0.05)，治疗组上述2指标较模型组下降(P<0.05)。结论霉酚酸酯可能通过下调肾脏TLR4、IL-18蛋白的表达对糖尿病肾病大鼠的肾脏起保护作用。

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)逐渐成为我国慢性肾病发病的最主要原因。近年来许多研究[1-3]发现炎症机制在DN发生发展中起重要作用。Toll样受体-4(TLR4)在机体炎症反应过程中发挥重要作用。TLR4可表达于肾小球足细胞和系膜细胞，与配体结合后，激活其信号传导级联反应，促进机体释放如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-8(IL-8)等炎症因子，加重蛋白尿，损伤肾脏。霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)是一种新型免疫抑制剂，能够抑制机体炎症反应，保护肾脏。作者观察了霉酚酸酯对DN大鼠肾脏TLR4、IL-18表达的影响，探讨DN的发病机制及MMF的治疗机制。

1 材料与方法

1.1材料雄性SD大鼠36只，体重200～275 g(郑州大学实验动物中心提供)。链脲菌素(STZ，美国Sigma公司)，MMF(杭州中美华东制药有限公司)，兔抗大鼠TLR4多克隆抗体、兔抗大鼠IL-18多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，SP法试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，辣根酶标记的山羊抗兔IgG (美国Jackson公司)，PVDF转印膜(美国Pall公司)，ECL化学发光试剂盒(美国Pierce公司)。

1.2实验动物分组与标本采集36只大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为对照组(n=12)和DN组(n=24)。DN组给予腹腔一次性注射STZ 55 mg/kg造模。72 h后开始监测空腹血糖，空腹血糖>16.7 mmol/L为糖尿病大鼠模型制作成功。3周后尿糖强阳性且24 h尿微量白蛋白排泄率>30 mg即为DN大鼠模型制作成功。造模成功的22只大鼠随机分为模型组和治疗组，每组11只。治疗组每天给予MMF 15 mg/kg灌胃，余2组按体重每天给予相当量溶媒灌胃。标本收集：于12周末收集24 h尿液，采用全自动生化分析仪测24 h尿蛋白量。腹主动脉取血，测血糖(Glu)、肌酐(creatinine，Cr)、胱抑素(cystatin-C，Cys-C)。4 ℃、生理盐水反复灌洗肾脏后，游离左肾，甲醛固定、梯度乙醇脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋，用于肾组织形态学观察。游离右肾，冰上取肾皮质切成小块，立即置于液氮中，再转入-70 ℃ 冰箱待测肾组织TLR4、IL-18。

1.3肾组织形态学观察肾组织3 μm连续切片，常规脱蜡，行HE染色、PAS染色观察肾组织大体形态学变化。

1.4肾组织TLR4和IL-18蛋白的免疫组化检测

采用SP法。石蜡切片脱蜡水化后，体积分数3%H2O2处理内源性过氧化氢酶，抗原热修复，山羊血清封闭后，分别滴加兔抗大鼠TLR4多克隆抗体(按1:100稀释)、兔抗大鼠IL-18多克隆抗体(按1:100稀释)。37 ℃孵化30 min,4 ℃过夜。加入生物素二抗室温孵育30 min，滴加DAB显色液，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。PBS代替一抗作阴性对照。棕黄色为阳性着色。德国 Lecia 显微照像系统采集图像，Biosens Digital Imaging System v1.6软件分析图像，每张切片高倍镜下取20个视野，测定肾小球阳性区积分光密度值，取均值。

1.5肾组织TLR4、IL-18蛋白的Westernblot检测称取100 g肾组织置于裂解液中冰上匀浆，取上清，BCA法蛋白定量。取60 μg蛋白煮沸5 min，经120 g/L SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉溶液室温摇床封闭1 h，加入兔抗大鼠TLR4、IL-18多克隆抗体(按1:1 000稀释) ，4 ℃过夜孵育，TBST摇床洗膜10 min×3 次，辣根酶标记的山羊抗兔IgG(按1:4 000稀释) 杂交，室温孵育2 h，TBST 摇床洗膜10 min×3次，暗室中加ECL发光剂，曝光、显影、定影，用图像分析系统对杂交信号进行光密度扫描，用 QuantityOne 图像分析软件分析目标条带的光密度值。

1.6统计学处理采用 SPSS 17.0处理数据。应用单因素方差分析比较3组大鼠肾组织各生化指标及TLR4和IL-18蛋白表达的差异，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组大鼠生化指标比较12周时，与对照组比较，模型组和治疗组24 h尿蛋白量，血Glu、Cr、Cys-C均升高；与模型组比较，治疗组24 h尿蛋白量、血Cr、Cys-C均下降，模型组与治疗组血Glu差异无统计学意义。 见表1。

表1 各组大鼠生化指标

*：与对照组比较,P<0.05；▲：与模型组比较，P<0.05。

2.2 3组大鼠肾脏病理改变及TLR4、IL-18蛋白的免疫组化染色结果肾组织HE染色显示：与对照组比较，模型组肾小球体积增大，炎症细胞浸润增加；治疗组较模型组有所改善。肾组织PAS染色显示：与对照组比较，模型组肾小球体积增大，基底膜增厚，炎症细胞浸润增加；治疗组较模型组有所改善(图1)。TLR4在正常肾小球系膜细胞、足细胞少量表达。IL-18在正常肾小球系膜细胞少量表达。TLR4、IL-18在模型组的表达较对照组升高，TLR4、IL-18在治疗组表达较模型组下降。见图2、表2。

图1 各组大鼠肾脏PAS染色结果(PAS，×400)

图2 各组大鼠肾组织TLR4(A)、IL-18(B)蛋白的表达(SP, ×400)

表2 各组大鼠肾组织TLR4、IL-18蛋白的表达

*：与对照组比较,P<0.05；▲：与模型组比较，P<0.05。

2.3 3组大鼠肾组织TLR4、IL-18蛋白的Westernblot检测结果见图3、表3。

图3 3组TLR4、IL-18蛋白的Western blot检测结果

表3 各组大鼠肾组织中TLR4、IL-18蛋白的表达

*：与对照组比较,P<0.05；▲：与模型组比较，P<0.05。

3 讨论

TLR4可在肾小球足细胞、包曼氏囊和系膜细胞表达。研究[4-5]发现TLR4可表达于足细胞，配体与TLR4结合后可使足细胞表达的TLR4明显上调，加重肾小球损伤。此外，TLR4与热休克蛋白60、硫酸乙酰肝素、纤维蛋白原、高迁移率族蛋白1等内源性配体结合后，通过髓样分化因子88 (MyD88)依赖型和MyD88非依赖型2条通路进行信号转导，激活NF-κB而导致瀑布式炎症反应。NF-κB激活后可促进MCP-1等炎症因子释放增加，趋化中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞等向肾脏局部聚集，损伤肾小球滤过膜，加重蛋白尿，损伤肾脏。Liu等[6]研究证实TLR4通过激活炎症反应在DN的发病过程中起重要作用。IL-18是一种具有多种生物学活性的细胞因子，能够通过活化单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等不同细胞，在DN的发病机制中起重要作用。Elsherbiny等[7]研究表明活化的肾小球系膜细胞能够分泌IL-18，促进系膜细胞增殖和释放细胞因子，加剧炎症细胞在肾小球内的聚集，损伤肾小球滤过膜。陈宝平等[8]研究显示：DN患者血清IL-18 水平高于对照组，并与尿白蛋白排泄率呈正相关。该研究结果亦证实模型组大鼠肾脏TLR4、IL-18表达明显升高，其机制可能为TLR4激活NF-κB导致瀑布式炎症反应。

MMF是一种高选择性免疫抑制剂，口服吸收后在体内形成霉酚酸，能够特异性抑制淋巴细胞增殖。近年来研究[9-10]发现MMF对DN有明显的治疗作用，可通过减轻足细胞损伤，减少单核细胞和淋巴细胞浸润等机制保护肾功能。该研究发现，MMF治疗12周后，治疗组肾脏病理较模型组明显改善，这与张燕等[11]的研究结果相似。治疗组大鼠24 h尿蛋白量、血Cys-C、Cr水平明显降低。免疫组织化学及Western blot检测发现模型组大鼠肾脏TLR4、IL-18表达降低，提示MMF可能通过降低DN大鼠肾脏TLR4的表达，进而降低IL-18的表达，减少尿蛋白，保护肾脏。MMF抑制TLR4表达的具体机制尚不清楚，有待进一步研究。

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(2013-12-06收稿 责任编辑徐春燕)

Effects of mycophenolate mofetil on expressions of TLR4 and IL-18 in kidneys of diabetic nephropathy rats

SHENPengxiao,WANGJiansheng，ZHAOYingying

DepartmentofNephrology，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

diabetic nephropathy;mycophenolate mofetil;TLR4;IL-18；rat

Aim: To investigate the effects of mycophenolate mofetil(MMF) on the expressions of TLR4 and IL-18 in kidneys of diabetic nephropathy rats. Methods: SD rats were allocated into 3 groups: normal control group(n=12)，diabetic nephropathy group(model group,n=11)，and treatment group(n=11)．The latter 2 groups were established diabetic nephropathy model. The treatment group was given MMF at 15 mg/kg per day,and the other 2 groups were given the solvent.Twelve weeks later，kidney pathology was observed using HE staining and PAS staining．Immunocytochemistry and Western blot were used to detect the expressions of TLR4 and IL-18.Results: HE staining and PAS staining of nephridial tissue showed that glomerular volume，thickness of glomerular basement membrane and infiltration of inflammatory cells in the model group increased significantly compared with the normal control group． Improvements were observed in the treatment group． The differences in the expressions of TLR4 and IL-18 in nephridial tissue among three groups were statistically significant．The expressions of TLR4 and IL-18 in nephridial tissue in model group were higher than those in normal control group(P<0.05).Conclusion: The protective role of MMF may be associated with the decrease of TLR4 and IL-18 in diabetic nephropathy rats.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.011

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