豫医卷毛大鼠转化生长因子α基因的比较生物学分析*

张明昊，章金涛

1)河南中医学院基础医学院医学机能实验室 郑州 450046 2)郑州大学实验动物中心 郑州 450052

豫医卷毛大鼠转化生长因子α基因的比较生物学分析*

张明昊1)△，章金涛2)

1)河南中医学院基础医学院医学机能实验室 郑州 450046 2)郑州大学实验动物中心 郑州 450052

△男，1982年7月生，硕士，实验师，研究方向：动物遗传学，E-mail:zhangminghao@139.com

卷毛大鼠；转化生长因子α；同源性比较

目的：对豫医卷毛大鼠的转化生长因子α(TGFα)基因进行比较生物学分析。方法采用PCR方法对豫医卷毛大鼠TGFα的cDNA序列进行克隆、测序，并与BN大鼠、小家鼠、黄牛、野猪、猕猴、黑猩猩、人、原鸡、鹌鹑和斑马鱼的TGFα cDNA序列及其编码产物的氨基酸序列进行同源性比较和系统遗传学分析。结果获得了豫医卷毛大鼠TGFα基因全长970 bp的cDNA序列(GenBank登录号：KF366251)。豫医卷毛大鼠与BN大鼠、小家鼠、黄牛、野猪、猕猴、黑猩猩、人、原鸡、鹌鹑和斑马鱼的同源性分别为98.6%、95.0%、85.5%、85.3%、85.5%、86.3%、86.3%、73.2%、73.2%和56.8%，氨基酸序列的同源性分别为98.8%、96.9%、90.6%、90.6%、91.2%、91.9%、91.9%、72.6%、72.6%和38.8%。结论TGFα基因在进化过程中具有较高的保守性，但不同物种之间也具有功能上的特异性。

转化生长因子α(transforming growth factor α, TGFα)是表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)家族的主要成员之一，最初被发现于逆转录病毒转化的成纤维细胞的培养基中，因其可诱导大鼠肾成纤维细胞增生而得名[1]。TGFα和EGF具有相同的受体EGFR，通过与之结合可使正常细胞有丝分裂活跃，促进细胞增殖，并在胚胎发育、创伤修复、肿瘤及毛囊和眼的发生等过程中起重要作用[2-4]。卷毛突变是一种较为少见的基因突变，该种突变动物的被毛和胡须均发生弯曲。国外已报道了几种类型，如wave-1、wave-2、cub、swh等[5-7]，国内少有报道。作者曾于2006年在SD大鼠繁殖种群中发现了1只被毛卷曲的雌性大鼠，经遗传测交实验证实该卷毛性状受常染色体上单一显性基因控制，呈现半显性遗传，现已被命名为豫医卷毛大鼠(Yuyi curly hair rat, YCHR)[8-10]。有报道[11]指出，小鼠胚胎缺乏TGFα就会产生波纹状鼠，这种鼠的眼部发育畸形，胡须和毛发呈现明显的波纹状，而导致此性状出现的致波纹基因就是TGFα基因的等位基因。由此可见，TGFα是毛发生长发育过程中的重要基因之一，对其进行深入研究将有助于了解该基因在生物体生长发育过程中的作用，并且揭示毛发卷曲及波纹状性状产生的机制。为了深入研究YCHR和其他物种TGFα基因cDNA序列的同源性，作者克隆了YCHR TGFα基因的cDNA序列，并与GenBank上发布的其他物种的TGFα基因cDNA序列进行了同源性比较，旨在进一步探讨TGFα基因的同源性及其比较生物学特征。

1 材料与方法

1.1实验动物8周龄YCHR 10只，雌雄各半，由郑州大学实验动物中心提供，一级环境条件下饲养。

1.2TGFα基因cDNA序列的扩增与测序DNA的提取及处理：处死大鼠后立即取脑组织，用液氮速冻后贮存于-196 ℃液氮罐中，用DNA提取试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)提取总DNA，保存于-80 ℃冰箱中待用。

引物设计及合成：根据GenBank上发布的大鼠TGFα基因cDNA序列(GenBank登录号：NM012671)，采用DNAStar软件包的PrimerSelect程序设计了5对重叠引物(表1)，用以扩增SD大鼠TGFα基因的cDNA序列。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

两轮扩增测序：取适量的DNA进行PCR扩增。第1轮反应液组成：模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10×Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，5 U/μL Taq 酶 0.5 μL，dH2O 35.5 μL，总体系为50 μL。第1轮反应条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～50 s，25个循环；最后72 ℃修复延伸5 min，4 ℃保存。第2轮反应液组成：PCR产物0.2 μL，上、下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10×Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，dH2O 36.3 μL，总体系为50 μL。第2轮反应条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55～60 ℃退火35 s，72 ℃延伸30～50 s，35个循环；最后72 ℃修复延伸5 min，4 ℃保存。PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳检测，将有目的条带的PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司双向测序。

表1 扩增TGFα基因cDNA所用引物

1.3TGFα基因cDNA序列和氨基酸序列分析将获得的序列在GenBank上进行Blast初步比较分析，根据序列重叠区域拼接YCHR TGFα基因cDNA的完整序列，并下载BN大鼠(NM012671)、小家鼠(NM031199)、黄牛(XM002691233)、野猪(NM214251)、猕猴(XM002799271)、黑猩猩(XM001142892)、人(NM003236)、原鸡(NM001001614)、鹌鹑(AB258390)和斑马鱼(NM001144052)的TGFα基因序列，采用DNAMAN和DNASTAR软件进行同源性比较和系统遗传学分析。

2 结果

2.1YCHRTGFα基因cDNA的克隆PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到特异性的目的条带，产物大小与预期结果一致(图1)。测序结果在NCBI上经Blast比较分析，确认结果为TGFα基因序列。序列拼接显示YCHR TGFα基因的完整cDNA序列长970 bp。

2.2TGFα基因的比较生物学分析结果见表2、3，系统遗传分析结果见图2。TGFα基因的系统进化树显示，YCHR与BN大鼠处于一支，和小家鼠的亲缘关系较近，人和黑猩猩、黄牛和野猪、原鸡和鹌鹑以及斑马鱼分别处于另外的分支。

1：TGFα-1扩增产物；2：TGFα-2扩增产物；3：TGFα-3扩增产物；4：TGFα-4扩增产物；5：TGFα-5扩增产物。

1：YCHR；2：BN大鼠(NM012671)；3：小家鼠(NM031199)；4：黄牛(XM002691233)；5：野猪(NM214251)；6：猕猴(XM002799271)；7：黑猩猩(XM001142892)；8：人(NM003236)；9：原鸡(NM001001614)；10：鹌鹑(AB258390)；11：斑马鱼(NM001144052)。

表3 YCHR与其他物种TGFα氨基酸序列的同源性比较 %

1：YCHR；2：BN大鼠(NP036803)；3：小家鼠(NP112476)；4：黄牛(XP002691279)；5：野猪(NP999416)；6：猕猴(XP002799317)；7：黑猩猩(XP001142892)；8:人(NP003227)；9:原鸡(NP001001614)；10:鹌鹑(BAF49419)；11:斑马鱼(NP001137524)。

图2 TGFα基因的系统进化树

3 讨论

TGFα作为推动细胞周期的因子，广泛分布于癌细胞、转化细胞和胚胎组织中，其与EGFR结合后，会导致受体相关的酪氨酸激酶活化，引发促进细胞分裂，与肿瘤的发生、发展密切相关[12]。TGFα基因也是一个重要的多效基因，它的突变可导致机体生长发育异常。为了深入了解TGFα基因组成的差异，作者克隆了TGFα基因cDNA序列(GenBank登录号：KF366251)，共计长970 bp，其中蛋白编码序列长度为483 bp。该基因编码的蛋白质由160个氨基酸残基组成。在此基础上，作者对包括YCHR在内的10个物种的11条TGFα基因的cDNA序列及其编码蛋白的氨基酸序列的同源性进行了分析，发现YCHR TGFα基因同GenBank上发布的BN大鼠、小家鼠、黄牛、野猪、猕猴、黑猩猩、人、原鸡、鹌鹑和斑马鱼的同源性分别为98.6%、95.0%、85.5%、85.3%、85.5%、86.3%、86.3%、73.2%、73.2%、56.8%，氨基酸序列的同源性分别为98.8%、96.9%、90.6%、90.6%、91.2%、91.9%、91.9%、72.6%、72.6%、38.8%，表明该基因在哺乳动物中具有较高的保守性，其编码蛋白可能具有相同的结构域，仅在哺乳类、鸟类和鱼类之间存在一定的功能上的差异。进一步分析 TGFα基因及编码蛋白，发现该基因在人类与各种模式生物之间存在着一定的序列与功能上的异同点，利用这一特点，可把来源于其他模式生物的 TGFα基因作为人类TGFα基因的天然突变体来进一步研究其结构和功能。

综上所述，作者克隆并获得了YCHR TGFα基因cDNA的完整序列，已提交给GenBank，并通过对不同物种TGFα基因及氨基酸序列的同源性比较，初步了解了 TGFα基因在物种进化上的保守性与特异性，为下一步进行 TGFα基因的多态性检测以及其与毛发生长和YCHR某些性状的相关性研究积累了基础资料。

[1]王海久,邓勇,侯立朝,等.TGF-α在肝硬化大鼠部分肝切除后的表达研究[J].中国医药指南,2012,10(20):5

[2]Wells A.Tumor invasion: role of growth factor-induced cell motility[J].Adv Cancer Res,2000,78:31

[3]Casalini P,Iorio MV,Galmozzi E,et al.Role of HER receptors family in development and differentiation[J].J Cell Physiol,2004,200(3):343

[4]Moustafa ME,Carlson BA,Anver MR,et al.Selenium and selenoprotein deficiencies induce widespread pyogranuloma formation in mice, while high levels of dietary selenium decrease liver tumor size driven by TGFα[J].PLoS One,2013,8(2):e57389

[5]Sibilia M,Wagner B,Hoebertz A,et al.Mice humanised for the EGF receptor display hypomorphic phenotypes in skin, bone and heart[J].Development,2003,130(19):4515

[6]Johnson KR,Lane PW,Cook SA,et al.Curly bare(cub), a new mouse mutation on chromosome 11 causing skin and hair abnormalities, and a modifier gene(mcub) on chromosome 5[J].Genomics,2003,81(1):6

[7]Kuramoto T,Morimura K,Nomoto T,et al.Sparse and wavy hair: a new model for hypoplasia of hair follicle and mammary glands on rat chromosome 17[J].J Hered,2005,96(4):339

[8]章金涛,杜春燕,王纯耀,等.豫医卷毛大鼠的遗传特性[J].郑州大学学报:医学版,2007,42(4):626

[9]章金涛,张明昊,王纯耀.豫医卷毛大鼠表皮生长因子受体基因的比较生物学分析[J].郑州大学学报:医学版,2011,46(3):351

[10]史崇敏,张明昊,朱奎成,等.豫医卷毛大鼠表皮生长因子基因的比较生物学分析[J].郑州大学学报:医学版,2013,48(4):447

[11]王生存,缪进,刘春,等.TGF-α在B6-Co小鼠胚胎发育后期眼睑中表达变化[J].江苏医药,2012,38(3):255

[12]国长军,张华平,邢建华.转化生长因子TGF-α和p53基因在大肠癌组织中的表达及意义[J].山东医药,2011,51(51):31

(2014-02-27收稿 责任编辑徐春燕)

Comparative biology analysis of TGFα gene from Yuyi curly hair rats

ZHANGMinghao1),ZHANGJintao2)

1)MedicalScienceFunctionLaboratory,SchoolofBasicMedicine,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046 2)LaboratoryAnimalCenter,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

curly hair rat; transforming growth factor α; homology comparison

Aim: To study the difference of transforming growth factor alpha(TGFα) gene between Yuyi curly hair rats and other species. Methods: PCR technique was developed to clone the sequence of cDNA of TGFα gene from Yuyi curly hair rats, and biologic characters of nucleotide and amino acid sequence encoding TGFα gene in different species (rattus norvegicus, mus musculus,bos taurus, sus scrofa, macaca mulatta, pan troglodytes, homo sapiens, gallus gallus,coturnix japonica, and danio rerio) were analyzed. Results: A full-length cDNA of Yuyi curly hair rats was 970 bp (Accession Number: KF366251). The TGFα gene nucleotide homology of Yuyi curly hair rats to rattus norvegicus, mus musculus,bos taurus, sus scrofa, macaca mulatta, pan troglodytes, homo sapiens, gallus gallus,coturnix japonica and danio rerio was 98.6%, 95.0%, 85.5%, 85.3%, 85.5%, 86.3%, 86.3%, 73.2%, 73.2% and 56.8%, and that of amino acid sequences was 98.8%, 96.9%, 90.6%, 90.6%, 91.2%, 91.9%, 91.9%, 72.6%, 72.6% and 38.8%, respectively. Conclusion: A high degree of conservation of TGFα gene exists among different mammalian taxons,but there are some specificities among different species.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.002

*国家自然科学基金资助项目 31071923

Q953