青蒿素对小鼠Lewis肺癌的抑制及TNF-α和IFN-γ的影响*

★ 郑绍琴 刘亚军* 宋健平 高岩 邓长生

(1.广州中医药大学科技产业园 广东 广州 510445；2.广州中医药大学 广东 广州 510405)

恶性肿瘤是对人类健康和生命威胁最严重的疾病之一，而肺癌是发病率最高的恶性肿瘤之一，据全球2002年癌症统计资料，无论从发病率和死亡率来看，肺癌都排在所有恶性肿瘤之首。目前对于肿瘤的治疗主要包括手术、放射治疗、化学治疗和生物免疫治疗。化疗在绝大多数的恶性肿瘤治疗中有着重要的地位，尤其在肺癌的治疗中发挥着重要的作用，但化疗的有效率低，毒副作用大，中药联合化疗药物提高化疗的有效率已成为目前研究的热点。青蒿素artemisinin,ART)是中国药学工作者1971年从菊科植物黄花蒿叶中提取分离到的一种具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物，因其毒性低、抗疟性强，被WHO批准为世界范围内的治疗脑型疟和恶性疟的首选药物。近年来国内外许多学者研究发现，青蒿素类药物不仅是一种抗疟药物，而且具有一定的抗肿瘤细胞活性和抑制肿瘤的作用。虽然在这方面目前国内外尚缺乏大样本的研究报道，但众多的研究表明青蒿素及其衍生物应用于临床肿瘤治疗的前景是非常好的。本实验旨在拓宽青蒿素作为化疗辅助用药的适应证，并初步探讨青蒿素对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及机制。

1 材料

1.1 药物 青蒿素(广州汉方现代中药研究有限公司，批号为100651)，注射用0.5%环磷酰胺(0.2g/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号11050821)。

1.2 动物 健康C57BL/6小鼠70只，雌雄各半，4～6周龄，小鼠质量16±2g，由广东省实验动物中心提供，动物质量合格证：SCXK(粤)2008-0002。

1.3 瘤株 小鼠Lewis瘤株，由广州中医药大学青蒿中心提供。

1.4 试剂 NF-α和IFN-γ ELISA试剂盒：购于广州博胜生物技术有限公司。

1.5 主要仪器 37XAZ型倒置显微镜，上海光学仪器厂；SW-CJ-IF超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；洗板机BIORAD 1575；酶标仪BIORAD MODEL 680。

2 方法

2.1 肺癌动物模型的建立 在无菌条件下，取传代10d的Lewis肺癌瘤源小鼠，颈椎脱臼处死，无菌操作从腋部皮下剥取肿瘤组织，研磨后按1∶3比例加生理盐水稀释成瘤细胞悬液，并调整细胞浓度为1×107/mL，取C57BL/6J小鼠，每鼠0.2mL右前肢腋部皮下注射。

2.2 动物分组及给药 健康C57BL/6J小鼠70只，随机分出10只作为正常对照组，其余动物造模24h后称重，并随机分为模型对照组、阳性对照组(CTX)、联合用药组(CTX+ART)，ART高、中、低剂量组，每组10只。分组后模型对照组和正常对照组，灌胃给予等容积CMC-Na溶液；ART高、中、低剂量组分别按200mg/kg、100mg/kg、25mg/kg灌胃给药，每日1次，连续12d；阳性对照组CTX按20mg/kg每鼠腹腔注射0.2mL，每日1次，连续12d；联合用药组CTX按20mg/kg每鼠腹腔注射0.2mL，ART按100mg/kg灌胃给药，每日1次，连续12d。治疗期间每天观察小鼠对治疗的反应、活动情况、精神状态、脱毛等情况。

2.3 肿瘤体积变化曲线 分组给药后，隔天测一次各组小鼠肿瘤组织的长短径，计算肿瘤体积：

V(mm3)=0.5×长径×短径×短径

计算瘤体积，取均值绘制肿瘤体积变化曲线。

2.4 脾质量、胸腺质量和抑瘤率计算 末次给药后24h，颈椎脱臼处死小鼠，剥取瘤块，分离胸腺和脾脏并称重。按下列公式计算抑瘤率：

2.5 联合用药协同作用评价 联合用药效果按金氏公式评价[1]：

其中Ea+b为两药合用的抑制率，Ea和Eb为各药单用时的抑制率，当q<0.85时表示两药合用有拮抗作用；q>1.15时，表示两药有协同作用；当0.85

2.6 血清TNF-α和IFN-γ含量测定 第13d动物称重后，无菌条件摘眼球取血，静置4h，离心并分离血清，置-20℃冰箱备用。采用ELISA双抗体夹心法测定IFN-γ、TNF-α含量。根据试剂盒的操作说明，向预先包被了IFN-γ、TNF-α多克隆抗体的酶标孔中加入待测样品，温育；洗涤后，依次加入底物A、B,底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，再次在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中C57小鼠IFN-γ、TNF-α的浓度呈正相关。用酶标仪测定吸光度OD值，通过标准曲线计算小鼠血清IFN-γ、TNF-α的含量。

3 结果

3.1 小鼠的一般情况观察 在实验前3d，各组右腋下注射部位未触及包块。模型组第4d开始，其它荷瘤组第6d始可在注射部位触及稍突起于皮面的质软肿块，造模的成功率为100%，皮下肿块外观呈球形或半球形，初起可活动，逐渐肿块变硬；肿瘤大小不一，后期部分小鼠肿瘤表面出现局部溃破结痂。一般情况观察如下:早期荷瘤C57小鼠身形匀称，动作敏捷，皮毛黑亮，顺滑有光泽，紧贴身体，无蓬松零乱，体重增长均匀，进食正常；随着肿瘤的增长，C57小鼠逐渐出现状态欠佳，进食水量减少，活动减少，行动迟缓，体重增长缓慢，至后期小鼠因肿瘤过大出现身体消瘦，活动迟缓，皮毛稀疏，精神萎靡，而且有脱毛情况。第13d各组陆续出现荷瘤小鼠死亡，其中模型对照组小鼠死亡出现最早。

3.2 肿瘤体积和肿瘤生长曲线图 至6d时，几乎所有小鼠都有大小不等的肿瘤包块，造模成功率100%。肿瘤逐渐增大，多数肿块为球状或半球状，至12d开始，部分小鼠肿瘤因过大出现中央皮肤暗红并逐渐出现溃烂结痴，小鼠因肿瘤过大而活动受限。12d时，Model组小鼠平均肿瘤体积明显大于各观察组(P<0.05)，提示CTX、青蒿素有一定的抑制肿瘤生长的作用。组间比较：与Model组比较，CTX组、ART+CTX及ART200 mg/kg(P<0.01),有显著性差异，提示CTX和ART200 mg/kg具有显著的抑瘤作用。由表所示，随着ART剂量的增加，肿瘤的体积逐渐缩小，提示ART的抑瘤作用与ART的剂量呈正相关。见表1和图1。

表1 各实验小鼠肿瘤体积比较±s)

图1 各组小鼠肿瘤生长曲线图

3.3 肿瘤质量和抑瘤率 由表2看出，青蒿素各剂量组对小鼠Lewis移植性肺癌均有显著的抑瘤作用。ART200mg/kg和100mg/kg剂量组的抑瘤率分别为36.06%、23.84%，CTX组抑瘤率为54.85%，ART联合CTX药物组抑瘤率为61.49%。以上各剂量药物组与模型对照组比较，除ART25mg/kg组外，均P<0.01有显著性差异。Model组小鼠肿瘤质量为1.506±0.160g，显著高于其它各组，提示青蒿素的各剂量组和CTX均有抑制Lewis肺癌荷瘤生长的作用。通过金氏公式求得联合用药组q=0.94,说明两药有相加作用。

表2 各组小鼠肿瘤质量及抑瘤率比较±s)

3.4 青蒿素对小鼠免疫器官的影响 由表3可以看出，CTX组小鼠脾脏和胸腺质量有所减轻，且ART联合CTX组胸腺重量亦有所减轻(P<0.01)，说明CTX可使小鼠的脾脏和胸腺受到抑制，对机体有一定的毒害作用。ART200mg/kg组胸腺与Model组比较有所减轻(P<0.05)，提示ART200mg/kg对胸腺有抑制作用。ART100mg/kg和25mg/kg剂量组对小鼠脾脏和胸腺质量无显著性变化，提示青蒿素中低剂量对小鼠胸腺和脾脏免疫器官没有损害，且小鼠胸腺和脾脏质量都有所增加。

表3 青蒿素对Lewis肺癌小鼠脾脏及胸腺的影响±s)

3.5 青蒿素对Lewis肺癌小鼠血清TNF-α和IFN-γ的影响 由表4可以看出，Lewis肺癌小鼠血清TNF-α量，与Normal组比较，CTX组小鼠TNF-α量为1.018±0.191ng/mL，显著低于Normal组(P<0.01)，具有显著性差异，ART200mg/kg组显著升高，ART100mg/kg和100mg/kg组虽有所升高，但不显著(P>0.05)；与Model组比较，ART200mg/kg和100mg/kg组小鼠血清TNF-α量升高(P<0.01)，有显著性差异。Lewis肺癌小鼠血清IFN-γ量，与Normal组比较，ART200mg/kg和100mg/kg组小鼠血清TNF-α量升高显著(P<0.01)，有显著性差异；与Model组比较，CTX组和联合组有所下降(P<0.05)，有显著性差异。ART100mg/kg和25mg/kg组升高(P<0.01)，有显著性差异。本实验结果显示青蒿素高中剂量组能促进TNF-α的产生，且随着剂量的增大，血清中TNF-α水平显著提高。青蒿素各剂量组亦能促进IFN-γ的产生，但以ART100mg/kg组最为显著。

表4 青蒿素对Lewis肺癌小鼠血清TNF-α和IFN-γ的影响±s)

4 讨论

结果显示：青蒿素200mg/kg和100mg/kg剂量组的抑瘤率分别为36.06%、23.84%，青蒿素联合CTX药物组的抑瘤率为61.49%，都具有统计学意义(P<0.01)，说明青蒿素具有抗Lewis肺癌的作用。在实验中，免疫器官的脏器质量是衡量机体免疫功能的初步指标，与模型对照组比较，虽然青蒿素对Lewis肺癌小鼠的胸腺质量和脾脏质量无显著差异，但是小鼠的胸腺和脾脏质量都有所增加。而阳性药物CTX和联合用药组，Lewis肺癌小鼠的胸腺质量和脾脏质量显著减少(P<0.01)，推测CTX可使小鼠的脾脏和胸腺受到抑制，对机体有一定的毒害作用。

近些年来研究发现，在肿瘤发生、发展过程中，细胞因子TNF-α与IFN-γ发挥着不可忽视的作用。目前TNF-α、IFN-γ可作为肿瘤治疗反应、治疗机制和治疗效果判断的生物学指标[2]。TNF-α在肿瘤机体免疫功能中是非常重要的细胞因子，近年来被用于肿瘤细胞的凋亡及联合化疗药物治疗，被认为是与肿瘤恶化有关的细胞因子，与肿瘤恶病质有关，同时又是一种免疫调节因子，具有调节机体免疫功能作用[3,4]。TNF-α具有直接杀伤肿瘤细胞的作用，体现在某些磷脂酶、蛋白酶和核酸酶等，这些酶都是杀伤肿瘤细胞不可缺少的水解酶。而且，它还可以通过间接作用杀伤肿瘤细胞，例如阻断肿瘤细胞血液供应，增加肿瘤血管内皮细胞的凝血活性，使血管内皮细胞受损，以及抑制血管内皮细胞迁移等[5]。本实验结果显示青蒿素能促进TNF-α的产生，而且随着剂量的增大，血清中TNF-α水平显著提高。本实验结果还显示，青蒿素各组均能促进IFN-γ的产生，但以高剂量组最为显著。IFN-γ与肿瘤发生、发展及转移密切相关，有抗肿瘤细胞增殖作用，还有免疫调节作用，可介导T细胞对巨噬细胞的激活，并能直接增强巨噬细胞的杀伤能力；可诱导某些肿瘤细胞表达MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ类抗原，促进静止的CD4+T细胞变化为Th1细胞，并抑制Th2细胞的增殖，促进CD8+CTL的成熟，增强CD8+CTL和NK细胞的杀伤活性[6,7]。通过抑制肿瘤细胞的增生，改变肿瘤细胞表面的性能及诱发新的抗原而被免疫监视细胞识别并加以排斥，实现抗肿瘤效应和增强机体抗肿瘤能力。另外IFN-γ还可通过血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)基因转录发挥其抑制肿瘤血管生长的作用[8]。且本实验研究结果还显示，青蒿素对小鼠Lewis肺癌具有显著的抑制作用，表明青蒿素对动物肺癌的抑制与增强荷瘤小鼠细胞因子TNF-α、IFN-γ的免疫作用密切相关。

综上所述，青蒿素不但能显著抑制小鼠肺癌，而且能影响荷瘤小鼠外周血清TNF-α及IFN-γ细胞因子水平，从结果可以看出，随着其剂量的增加，可使血清中TNF-α的水平明显提高，而其还能显著提高血清中IFN-γ的水平。这为临床使用青蒿素抗癌机理从细胞因子水平上提供了一定的实验依据。

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