毛钩藤不同采收期总生物碱与多糖含量变化研究*

★ 唐才林 高言明 杨春 林昌虎 吴明花 徐东升

(1.贵阳中医学院 贵州 贵阳 550002；2.贵州理工学院 贵州 贵阳 550003；3.贵州科学院 贵州 贵阳 550001)

中国药典2010版上还未收载采用有效成分含量作为中药钩藤质量评价的标准[1]，钩藤药材的采收期是根据民间习惯于秋、冬二季采收。钩藤在临床上主要用于降压，其药效成分主要为生物碱类，本实验通过考察不同采收期毛钩藤中总生物碱与多糖含量的变化情况来研究毛钩藤的最佳采收期具有一定的现实意义。

1 仪器与试药

紫外-可见分光光度计(岛津UV-2501PC)；AE-240双量程电子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；pH计(上海精密科学仪器有限公司)。异钩藤碱对照品(批号：111927-201102，中国食品药品检定研究院)；醋酸，醋酸钠，溴甲酚绿，葡萄糖，氨水，三氯甲烷等均为分析纯，水为蒸馏水。药材样品采自贵州省开阳县翁昭村毛钩藤种植基地人工种植五年生毛钩藤，采样于2012年1月～2012年12月，按每月1～10号之内在同一毛钩藤种植区域中采取带钩老茎枝作为样品，经贵阳中医学院付志明鉴定为茜草科植物毛钩藤(UncariahirsuteHavil)，药材样品在室内阴干经粉碎后于45℃烘至恒重并置于干燥器中备用。

2 方法与结果

2.1 毛钩藤总生物碱含量分析[2]

2.1.1 溶液的制备

2.1.1.1 对照品溶液和供试品溶液的制备 取异钩藤碱对照品10.30mg，精密称定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为103.00μg/mL的对照品溶液。精密称取钩藤样品粉末约0.16g，置于50mL具塞的锥形瓶中，加入1%盐酸甲醇10mL，放入4℃冰箱中冷浸12h后取出，室温超声45min，滤过，再加入1%盐酸甲醇10mL，室温超声45min，滤过，合并滤液于蒸发皿中，置60℃水浴中挥干滤液，残渣加10mL稀氨水溶解，使溶液呈碱性，转移至分液漏斗中，加10mL氯仿，充分振摇萃取3min，静置分层，收集氯仿层，反复萃取3次，将合并的氯仿层于蒸发皿中60℃水浴挥干，残渣加pH=3.4的缓冲液和酸性染料各5mL，溶解后转移至分液漏斗中，精密加入10mL氯仿，充分振摇萃取3min，静置分层，收集氯仿层，反复萃取3次，合并氯仿层溶液，即为显色后的供试品溶液。

2.1.1.2 醋酸-醋酸钠缓冲溶液的制备 配制0.2mol/L的醋酸钠溶液250mL，0.2mol/L的醋酸溶液500mL，备用，使用之前按醋酸钠溶液约0.88mL与醋酸溶液约24.12mL混匀，用pH计精密调至pH=3.4。

2.1.1.3 溴甲酚绿酸性染料溶液的制备 称取溴甲酚绿0.25g，加0.05mol/L的氢氧化钠溶液5mL研磨，再加水配成500mL，用三氯甲烷洗弃脂溶性杂质至三氯甲烷层不显色，储存于500mL容量瓶中备用。

2.1.2 测定波长的选择 分别用按2.1.1.1项制备并显色后的供试品和对照品溶液，同法制备空白溶液，在紫外-可见分光光度计300～500nm波长范围内扫描，得最大吸收波长为410nm。

2.1.3 显色条件的选择

2.1.3.1 缓冲液pH值的选择 由于在显色体系中pH值对显色效果影响最大，因此首先配制pH值分别为3.1，3.4，3.6，3.8，4.0，4.2，4.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。精密量取6份异钩藤碱对照品溶液各5mL于蒸发皿中，60℃水浴上挥干溶剂后分别用以上缓冲溶液各5mL和5mL溴甲酚绿酸性染料溶解残渣,转移至分液漏斗中，再精密加入10mL氯仿，充分振摇萃取3min，静置分层，收集氯仿层，反复萃取3次，合并氯仿层溶液，同法制备7个相应pH值的空白溶液，于紫外-可见分光光度计410nm波长处测定吸光度，结果见表1。结果显示缓冲溶液pH为3.4时吸光度最大，故选择之。

表1 缓冲溶液不同pH值试验结果

2.1.3.2 溴甲酚绿溶液用量的选择 精密吸取对照品溶液共5份，每份2mL，于蒸发皿中在60℃水浴锅上缓慢蒸干，分别加入pH为3.4的缓冲溶液5mL和不同体积的溴甲酚绿酸性染料溶解残渣，按2.1.3.1项“转移至分液漏斗中”同法操作，并同法制备5个相应溴甲酚绿酸性染料用量的空白溶液在410nm波长处测定吸光度。结果见表2，可知溴甲酚绿酸性染料用量为5mL时较为适宜。

表2 溴甲酚氯染料用量选择试验结果

2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取浓度为103.00μg/mL的异钩藤碱对照品2.0，4.0，5.0，7.0，9.0mL于5个10mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得一系列浓度梯度的对照品溶液。分别精密吸取上述各浓度的对照品溶液5mL于蒸发皿中60℃水浴上挥干，残渣按2.1.1.1项下“残渣加pH=3.4的缓冲液和酸性染料各5mL”起同法操作，以相应试剂为空白，用紫外-可见分光光度计在410nm波长处测定吸光度，以对照品的浓度(μg/mL)为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)进行回归计算，得总生物碱的回归方程为：Y=0.053X+0.0422，r=0.9997。结果表明总生物碱在3.43～15.45μg/mL的范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密吸取按上述方法制备的对照品溶液5mL，显色后，分别测定6次吸光度，计算RSD为2.41%。

2.1.6 稳定性试验 精密吸取按“2.1.1.1”项下制备的供试品溶液，分别在0，0.5，1，1.5，2，2.5，3h进行吸光度测定，计算RSD为1.38%，表明供试品溶液在3h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取3月份采收的毛钩藤样品粉末6份，每份约0.16g，分别置于6个50mL具塞锥形瓶中，按“2.1.1.1”项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液，同法作试剂空白，用紫外-可见分光光度计在410nm处测定吸光度，计算出该钩藤药材的总生物碱(以异钩藤碱计)的平均含量为0.17%，RSD为1.81%。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取已知总生物碱平均含量为0.17%的毛钩藤样品粉末6份，每份约0.08g，分别置6个50mL具塞锥形瓶中，每份分别精密加入浓度为144.00μg/mL的异钩藤碱对照品1mL，按“2.1.1.1”项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液，同法作试剂空白，用紫外-可见分光光度计在410nm处测定吸光度，计算得平均回收率为100.78%，RSD%为2.81。

2.1.9 样品含量测定 按2.1.1.1项下制备方法，对各毛钩藤样品进行供试溶液制备，每份样平行3份，同法作试剂空白，用紫外-可见分光光度计在410nm处测定吸光度，计算出总生物碱(以异钩藤碱计)的含量，结果见表1。

2.2 毛钩藤多糖含量分析[3]

2.2.1 对照品溶液和供试品溶液的制备 取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.0903g，精密称定，置100mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为903.00μg/mL的对照品溶液。取毛钩藤样品粉末约0.4g，精密称定，置于100mL圆底烧瓶中，加水50mL，称定重量，静置1h，加热回流1h，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，过滤。精密吸取续滤液10mL，置100mL的容量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取2mL，置具塞的比色管中，精密加入4%苯酚溶液1mL，混匀，迅速精密加入浓硫酸7mL，摇匀，置40℃水浴中保温30min，取出，放冷至室温，即得供试品溶液。

2.2.2 苯酚溶液的制备 称取已重蒸馏过的苯酚10.00g，置于250mL的容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，得浓度为4%的苯酚溶液，备用。

2.2.3 线性关系考察 分别精密吸取浓度为903.00μg/mL的葡萄糖对照品溶液2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，8.0mL，分别置于6个100mL的容量瓶中，各加水稀释至刻度，摇匀，得一系列浓度梯度的对照品溶液。分别精密吸取上述浓度的对照品溶液2mL，置具塞比色管中，各精密加入4%苯酚溶液1mL，混匀，迅速精密加入浓硫酸7mL，摇匀，置40℃水浴中保温30min，取出，放冷至室温，同法做试剂空白，用紫外-可见分光光度计在488nm波长处测定吸光度，以对照品的浓度(μg/mL)为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)进行回归计算，得多糖的回归方程为：Y=0.0545X+0.0015，r=0.9994。结果表明多糖在4.52～14.45μg/mL的范围内线性关系良好。

2.2.4 精密度试验 精密吸取浓度为903.00μg/mL的对照品溶液5mL，置于100mL的量瓶中，加水稀释至刻度，得浓度为45.15μg/mL的对照品溶液，精密吸取上述对照品溶液2mL，显色后分别进行吸光度测定，以6次测得的吸光度计算RSD为2.49%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验 精密吸取按“2.2.1”项下制备的供试品(3月份采收样品)溶液，分别在0，1，1.5，2，2.5，3h进行吸光度测定，以测得的吸光度计算RSD为0.18%，表明供试品溶液在3h内稳定性良好。

2.2.6 重复性试验 取6份钩藤样品(3月份采收样品)粉末，每份约0.4g，精密称定，分别置于6个100mL圆底烧瓶中，按“2.2.1”项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液，同法作试剂空白，用紫外-可见分光光度计在488nm处测定吸光度，计算出该钩藤药材中的多糖(按葡萄糖计)的平均含量为7.42%，RSD为2.06%。

2.2.7 加样回收率试验 称取已知多糖平均含量为7.42%的钩藤样品粉末6份，每份约0.2g，精密称定，分别置于100mL圆底烧瓶中，每份分别精密加入浓度为281.18μg/mL的葡萄糖对照品溶液50mL，按“2.2.1”项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液，同法作试剂空白，用紫外-可见分光光度计在488nm处测定吸光度，结果平均回收率为98.57%，RSD%为2.70。

2.2.8 含量测定 称取钩藤样品，每样各3份，每份约0.4g，精密称定，按“2.2.1”项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液，同法作试剂空白，用紫外-可见分光光度计在488nm处测定吸光度，计算出多糖(按葡萄糖计)的含量，结果见表3。

表3 毛钩藤不同采收期总生物碱和多糖含量测定结果(n=3，%)

3 讨论

多糖并非毛钩藤的药效成分，然而通过实验观察到多糖含量与生物碱含量变化存在一定正相关性，可为分析毛钩藤内在质量变化提供辅助信息[4]。

毛钩藤中的总生物碱在全年通常气温相对较高的5～10月份时段含量相对较低，此时段多糖含量也呈现相应含量较低的状态，而在当年11月到次年4月份气温相对较低时段总生物碱含量相对较高，此时段多糖含量也呈现相应含量较高的状态，说明植物体内糖份的积累变化与生物碱的含量变化基本一致，气温的高低是毛钩藤中总生物碱及多糖含量有明显直接影响的因素。因此贵州开阳县翁昭村毛钩藤种植基地种植的毛钩藤采收期应选择气温相对较低的时段采收为宜，与中国药典2010版对钩藤采收期于“秋、冬二季采收”叙述有一定差异，这或许与特定地点的地理环境和气候有密切关系所致。

[1]国家药典委员会.中国药典·一部[S].北京：化学工业出版社，2010：240.

[2]曾常青,罗北亮.酸性染料比色法测定钩藤的总生物碱含量[J].中药材，2007，30(8)：1021-1024.

[3]国家药典委员会.中国药典·一部[S].北京：化学工业出版社.2010：206.

[4]蒋品，高言明，杨玉琴，等.龙胆不同采收期龙胆苦苷和多糖含量变化研究[J].江西中医药，2011,42(2)：55-57.