正交试验优选减味寿胎丸总黄酮提取工艺

★ 刘秀明 罗颂平 冯婷 方家 陈静静

(广州中医药大学 广东 广州 510405)

寿胎丸源自清代名医张锡纯的《医学衷中参西录》，由菟丝子、桑寄生、川续断和阿胶4味中药组成，为妇科安胎常用名方，临床上具有补脾益肾，养血固摄，安胎之功，能有效防治先兆流产。在临床上，较多学者选用寿胎丸加减或寿胎丸联合西药治疗胎漏、胎动不安及滑胎，从目前的报道来看，有效率均在90%左右，疗效确切[1-3]。课题组前期证实去阿胶的减味寿胎丸具有与寿胎丸基本相同的安胎效果，明确了该方最佳药效组合及配伍剂量，亦对减味寿胎丸进行了拆方研究，初步确定减味寿胎丸的黄酮类物质药效较为显著[4-10]。为了使减味寿胎丸的黄酮进一步合理开发和利用，本研究采用单因素结合正交试验设计法优选出减味寿胎丸中总黄酮的最佳提取工艺,为减味寿胎丸药效物质的提取提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 旋转蒸发仪系统(BUCHI)；实验室专用超纯水机(德国sartorius公司)；恒温水浴锅(上海一恒)；万分之一电子天平(德国sartorius公司)；十分之一电子天平(双杰牌)；紫外分光光度计(尤尼科(上海)仪器有限公司)。

1.2 试药 芦丁对照品(中国药品生物制品检定研究院，批号：10080-200707)；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠为分析纯试剂(天津大茂化学厂有限公司)；水为纯水；菟丝子(批号：121002111，产地：山东)和续断(批号：110108341，产地：山东)均购自康美公司，由广州中医药大学黄海波教授鉴定。桑寄生采摘自华南植物园，由华南植物园叶华古研究员鉴定。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品约10mg，精密称定至10mL容量瓶，用60%乙醇超声溶解，放冷定容，得芦丁对照品溶液浓度为0.112mg/mL。

2.1.2 标准曲线的制备 精密吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL芦丁标准溶液，放入10毫升容量瓶内，分别加入5.0，4.0，3.0，2.0，1.0，0mL的60%乙醇溶液；加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀，放置6min；加入10%硝酸铝溶液0.3mL，放置6min后；加入4%氢氧化钠溶液4.0mL，加60%乙醇定容，摇匀后，放置15min；在510nm处测定吸光度。用0mL作为空白，用浓度(X)作为横坐标，以吸光度(Y)为纵坐标作标准曲线。得到回归方程为：Y=1.205X，r=0.9998，线性范围为0.112～0.56mg/mL。

2.2 单因素考察

2.2.1 乙醇浓度的考察 准确称取菟丝子4g，桑寄生3g，续断3g,粉碎过2号筛，分别加入10倍量的30%，50%，60%，70%，80%，95%乙醇，回流提取1次，提取时间1.0h，滤过，用少量相应溶剂洗涤药渣和容器，滤液与洗涤液定容至250mL容量瓶中，精密移取1mL至10mL的容量瓶中，用相应的溶剂稀释至刻度，精密移取1mL样品稀释液，按标准曲线制作项下“加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀”起，同法操作，显色后于510nm波长处测定吸光度，计算总黄酮浸出量。结果显示，乙醇浓度在30%～60%内，随着醇浓度升高，总黄酮浸出量逐渐增加，当乙醇浓度超过60%后，随浓度增加而递减。可见，当乙醇浓度达到60%时，总黄酮浸出量达到最大值。

表1 乙醇浓度考察

2.2.2 提取时间的考察 准确称取菟丝子4g，桑寄生3g，续断3g,粉碎过2号筛，加入10倍量的60%乙醇，回流提取1次，提取时间分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，滤过，用少量60%乙醇洗涤药渣和容器，滤液与洗涤液定容至250mL量瓶中，其余步骤同“2.2.1”。结果见表2，结果显示当提取时间为1h时，总黄酮浸出量达到最大值。

表2 提取时间考察

2.2.3 料液比及提取次数的考察 准确称取菟丝子4g，桑寄生3g，续断3g,粉碎过2号筛，分别加入6，8，10，12，14，16倍的60%乙醇，每份分别回流提取3次，每次1h，每次所得提取液分别滤过，定容，其余步骤同“2.2.1”。分别计算每次提取液总黄酮浸出量。

从表3可以看出，当料液比为1∶8时，累积总黄酮浸出量达到最大值。从表3中也可以计算出，第1、2次总黄酮浸出量已达累积总黄酮浸出量的95%以上，说明经过2次回流提取后，黄酮类物质已经提取充分，因此提取次数定为2次。

表3 料液比和提取次数的考察

2.3 正交试验 根据单因素考察结果及工业化生产实际，选择乙醇浓度、料液比和提取时间为考察因素，分别设定3个水平，根据因素水平表(见表4)，选择正交表(见表5)进行试验，以减味寿胎丸总黄酮浸出量为指标，可见分光光度法测定含量，利用minitab软件对正交试验的结果进行分析，结果见图1、表7。

根据图1主效应图和表6 minitab统计结果显示乙醇浓度及料液比对产出的影响先是正效应，后是负效应，当乙醇浓度在50%～60%间，随乙醇浓度增加而总黄酮浸出量增加，同理料液比亦然，系数列中绝对值：47.78>39.17>3.61，则(50%～60%，1∶08～1∶10区间)影响大小：A>B>C。在60%～70%间，随乙醇浓度增加而递减，同理料液比例亦然，系数列中绝对值：39.17>28.06>5.56，则(60%～70%,1∶10～1∶12区间)影响大小：B>A>C。表7方差分析结果显示，A(乙醇浓度)和B(提取时间)对减味寿胎丸总黄酮提取的影响有显著意义，是影响减味寿胎丸总黄酮回流提取工艺的主要因素，在工艺中应重点考虑，综合以上分析，减味寿胎丸最佳提取工艺：乙醇浓度为60%，料液比为1∶10，回流提取2次，每次提取时间为0.5h。

表4 因素水平表

表5 正交设计表

图1 主效应图

表6 minitab统计结果

表7 方差分析

2.4 最佳工艺验证试验 为进一步考察工艺的稳定性，按最佳提取工艺，平行重复3次试验：准确称取菟丝子4g，桑寄生3g，续断3g,粉碎过2号筛，加10倍体积60%乙醇，回流提取2次，每次0.5h，过滤定容至250mL，其余步骤同“2.2.1”。结果见表8，试验结果可以看出提取工艺具有良好的稳定性和重复性，适合减味寿胎丸总黄酮的提取。

表8 验证试验结果

3 讨论

减味寿胎丸的主要药效成分是黄酮类成分，成分较为复杂，黄酮苷一般能溶于水、稀乙醇、甲醇和乙酸乙酯等极性溶剂中。而黄酮苷元一般溶于乙醇、甲醇和乙酸乙酯、乙醚等溶剂中,不溶于水。故本试验选择乙醇水溶液作为提取溶剂。单因素考察和正交试验结果可见，在低浓度和高浓度乙醇提取时，总黄酮浸出量都较低，可能与减味寿胎丸黄酮类物质包含黄酮苷和黄酮苷元有关。

通过单因素考察及正交试验优化了减味寿胎丸总黄酮的提取工艺。最佳工艺参数为：乙醇浓度为60%，料液比为1∶10，回流提取2次，每次提取时间为0.5h。经验证重复性好，工艺简单，省时节能，为进一步研究减味寿胎丸提供参考。

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