肺腺癌细胞系H114的建立

冯 延 徐 瑜 胡义德

肺癌已成为我国恶性肿瘤发病率最高的疾病，其发病率为53.57/105，并成为我国恶性肿瘤的头号杀手，2009年肺癌的病死率达45.57/105，即我国每年死于肺癌的患者近70万人[1-2]。因此，肺癌在我国的肿瘤防治中占有特殊的地位。为进一步研究我国肺癌的发病机制、治疗方法及预防策略，本研究组应用原代培养的方法，在肺腺癌患者胸腔积液中新建立了一株人肺腺癌细胞系，旨在为我国肺癌研究提供新的模型。目前已经在体外培养8个月，传代40余代，生长稳定，定名为H114细胞系。现将建株经过报道如下。

材料与方法

一、实验材料

1. 肿瘤标本来源： 2013年1月14日取材于第三军医大学新桥医院肿瘤科胸腔穿刺抽取的肺腺癌性胸腔积液。患者男性，48岁，重庆市永川区人，其组织病理诊断为右上肺中-高分化管状腺癌T3N1M1 Ⅳ期，本次胸水脱落细胞检测查见癌细胞。

2. 主要试剂： 裸小鼠1只购于新桥医院实验动物中心，3周龄，雄性，体质量14 g，无菌层流室饲养。改良型RPMI 1640、胰酶购自美国HyClone公司。标准胎牛血清、淋巴细胞分离液购自美国TBD公司。红细胞裂解液购自天根生化科技(北京)有限公司。青霉素-链霉素溶液购自碧云天生物技术研究所。

3. 仪器设备： 二氧化碳恒温孵箱(Heal Force)购自香港力康发展有限公司。超洁工作台购自苏州苏洁净化设备有限公司。倒置显微镜购自日本Olympus公司。倒置荧光显微镜购自德国徕卡仪器有限公司。立式压力蒸汽灭菌器购自上海申安医疗器械厂。高速离心机购自长沙平凡仪器仪表有限公司。恒温水温箱购自上海浦东荣丰科学仪器有限公司。压力驱动无菌过滤器购自美国Millipore公司。

二、实验方法

1. 细胞培养： 选择我国男性肺腺癌患者，经患者及其家属同意，并签署知情同意书，在肿瘤科穿刺室获取胸腔穿刺抽取的胸腔积液200 ml，置无菌玻璃瓶中，迅速转入无菌实验室内，将上述胸腔积液在无菌操作台内分装于4个50 ml离心管中，以离心半径8 cm，2000 r/min离心15 min，弃上清，加入细胞沉淀体积的3～5倍红细胞裂解液，充分混匀，室温下以离心半径8 cm，1500 r/min 离心10 min，弃上清，若红细胞未裂解充分，可重复红细胞裂解步骤一次，然后按2︰1比例将细胞悬液轻轻滴入盛有淋巴细胞分离液的离心管，以离心半径8 cm，2000 r/min 离心15 min，见液体分为四层，弃上面三层，将最下层细胞用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的改良型RPMI1640制成细胞悬液；以1×106细胞密度接种于25 cm2无菌玻璃培养瓶中，置37 ℃、5%二氧化碳恒温孵箱中培养，当细胞贴满瓶壁的90%～95%时用0.25%胰蛋白酶消化后按1︰2～1︰3比例进行传代[3]。

2. 形态学观察： 每1～2 d将培养细胞放倒置荧光显微镜下观察细胞生长、增殖情况并拍照；倒置显微镜观察染色后细胞分裂指数。

3. MTT比色法测定肺腺癌细胞生长曲线： 细胞传到30代时，收集对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，血球计数板计数，按6×103细胞密度接种于96孔板，并做6个复孔，共接种7块培养板，同时以不加细胞只加等体积培养基的孔为空白对照，置37 ℃、5%二氧化碳恒温孵箱中分别培养24/48/72/96/120/148/172 h后；每孔加入20 μl的MTT溶液(5mg/mL)后继续培养4 h；培养结束后，小心吸去孔内培养液，每孔再加入150 μl二甲基亚矾(dimethyl sulfoxide, DMSO)，置摇床上低速震荡10 min使MTT蓝紫色结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪于490 nm处检测各孔细胞的吸光度(A)值。

4. 异种移植: 当细胞长满培养瓶80%时，用0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，以2×106个细胞(0.2 ml)接种于1只裸鼠(雄性)两侧臀部(购自新桥医院实验动物中心，动物合格证号SYXK渝2012-0011，SPF级)，每日观察瘤结节生长及转移情况，接种23 d后处死动物。

5. 细胞、组织苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色: 肿瘤细胞传到第14代时，当肿瘤细胞长满瓶壁80%时，用0.25%胰酶消化后计数，调整细胞数为1×105/ml后接种于含盖玻片的六孔板中，放入CO2孵箱培养一段时间(约2～3 d)后取出长有肿瘤细胞的盖玻片，然后按HE染色步骤做肺腺癌细胞HE染色；异种移植物分离后按组织切片HE染色步骤行肺腺癌组织HE染色。

结 果

一、原代及传代培养

细胞在含10%FBS的RPMI 1640培养基中贴壁生长，镜下见细胞为多边形或类圆形，极少数为梭行，呈细胞团样；细胞按1︰3传代，每2～3 d传代一次。现已经在体外培养8个月，传至40余代，目前细胞生长旺盛，状态良好，不依赖细胞生长因子维持生长，经液氮罐或-80 ℃低温冰箱反复冻存复苏后仍保持良好的增殖活性，复苏细胞经0.4%胎盘蓝染色，活细胞比率均保持在85%以上。

二、形态学观察

倒置显微镜下观察活细胞体积较大，多为类圆形贴壁生长，呈腺腔样排列，细胞接触抑制消失，重叠现象明显，见图1；HE染色见细胞核大、偏位、深染，圆形或椭圆形，染色质粗、不均匀，核仁明显、病理性核分裂象，核浆比例增大、倒置，胞浆内见丰富颗粒及空泡。符合肺腺癌细胞的特征，见图2。

图1 肺腺癌H114细胞形态(A、B图10×10；C、D图10×20)

图2 肺腺癌H114细胞HE染色(A:10×20；B:10×40；C：10×63)

三、MTT比色法检测肺腺癌H114细胞生长曲线

从细胞体外生长曲线可见：在整个168 h的观察时间里，肺腺癌H114细胞始终处于持续增殖状态，可见潜伏期和指数生长期，由于本细胞系传代次数较少，生长活跃，7 d还没出现平顶期和退化衰亡期，见图3。第24～96小时(潜伏期)，生长曲线斜率很小，缓慢上升，说明细胞增殖比较缓慢；第96～168小时(指数生长期)，生长曲线斜率较大，上升走势明显，说明增殖加快。

四、异种移植

采用断头处死裸小鼠后钝性分离左、右侧肿块，肿块重约0.40 g，大小约1.0 cm×0.9 cm×0.8 cm。肉眼观肿块呈鱼肉色，为圆形或类圆形，结节状，切面灰白，质稍硬。解剖裸小鼠未查见远处脏器转移灶，见图4。

五、组织切片HE染色

光镜下见肿瘤细胞呈巢状排列，细胞核大，核仁明显，病理性核分裂相多见，核浆比例增大，胞浆内见丰富颗粒及空泡，伴局灶性坏死，肿瘤细胞向周围肌肉及脂肪组织浸润，伴有炎性细胞浸润及纤维组织反应性增生，局部见坏死组织。符合肺腺癌细胞的特征，见图5。

图3 肺腺癌H114细胞生长曲线

图4 裸鼠成瘤及瘤结节

注：A：10×10；B：10×20；C：10×40

讨 论

肿瘤细胞对化疗药物的敏感性有明显的个体差异，同一种肿瘤的不同类型或同一类型的不同个体，甚至同一个体在疾病的不同阶段，其对化疗药物的反应性也不同，这些都是由于肿瘤异质性导致的。那什么是肿瘤异质性呢？肿瘤在生长、分裂、增殖过程中，由于子细胞在分子生物学或基因方面发生改变，使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性及预后等各方面产生差异称为肿瘤异质性，它是恶性肿瘤的特征之一。肿瘤异质性包括时间异质性、空间异质性、结构异质性、基因异质性、功能异质性和人为异质性[4]。此外，Brammer等[5]提出了位置异质性，他们发现肺外小细胞肺癌的预后与生长的部位密切相关，即解剖位置预测了肿瘤的生存期。并提出肿瘤位置的异质性可能对少见疾病的预后有影响。Crockford等[6]研究发现肿瘤不同的基因表达、不同的体细胞突变、肿瘤特异性的遗传特征和微环境的选择压力对成功预测治疗疗效有指示作用。由于肿瘤异质性的存在，使Forbes等[7]的溶肿瘤病毒的三期临床实验失败。这些研究都表明，肿瘤的异质性对肿瘤的治疗、预后有极重要的预测作用。因此，建立我国特有的肺腺癌细胞系对研究我国肺腺癌的发病机制、治疗、耐药、预后有重大意义。

目前，国内外已建立了许多肺癌细胞系，但由于肿瘤的异质性、多态性和复杂性，不同种族、国家及地区来源的同一种组织类型的肿瘤，其细胞的生物学特性也不相同。本研究建立了我国发病率及病死率都位居国内首位的肺癌细胞系，进一步丰富了我国肺癌细胞系的类型[8-10]。而且，体外培养、建立的国人肺癌细胞系对于针对性、个体化研究我国人群肺癌癌变、侵袭转移、能量代谢、多药耐药、生物学特征以及研发抗癌新药等方面均有十分重要的理论和临床意义[11-12]。

H114细胞系来源于重庆市永川区一男性肺腺癌患者的胸腔积液，肿瘤组织经临床病理诊断为右上肺中-高分化管状腺癌。在体外培养过程中，肿瘤细胞呈镶嵌或腺泡样排列，重叠性生长，异型性明显，分裂指数高。细胞HE染色见肿瘤细胞体积大，核浆比例失调，细胞浆染色改变，出现空泡，核大，核畸形怪状，染色深，见较多病理性核分裂相。MTT法测得的生长增殖曲线证明该细胞具有持续增值特性，这些均符合肺腺癌细胞的特点。异种移植实验和组织HE染色表明H114细胞是肺腺癌细胞，与培养前的组织类型、分化程度相似。以上结果证明，本研究建立了一株新的肺腺癌细胞系。

参 考 文 献

1 钱桂生. 肺癌不同病理类型发病率的变化情况及原因[J/CD]. 中华肺部疾病杂志: 电子版, 2011, 4(1): 1-6.

2 陈万青, 张思维, 郑荣寿, 等. 中国2009年恶性肿瘤发病和死亡分析[J]. 中国肿瘤, 2013, 22(1): 2-12.

3 司徒镇强, 吴军正. 细胞培养[M]. 第1版. 西安: 兴界图书出版公司, 2004: 65.

4 纪小龙. 肿瘤异质性的临床意义[J]. 北京军区医药, 2000, 12(1): 21-23.

5 Brammer JE, Lulla P, Lynch GR. Retrospective review of extra-pulmonary small cell carcinoma and prognostic factors[J]. Int J Clin Oncol, 2013, DOI 10.1007/s10147-013-0626-6.

6 Crockford A, Jamal-Hanjani M, Hicks J. Implications of intratumour heterogeneity for treatment stratification[J]. J Pathol, 2014, 232(2): 264-273.

7 Forbes NE, Abdelbary H, Lupien M, et al. Exploiting tumor epigenetics to improve oncolytic virotherapy[J]. Front Genet, 2013, 4: 184-195.

8 颜秉阳, 殷国强, 张志培, 等. 肺腺癌胸水肿瘤细胞分离与体外悬浮培养及鉴定[J]. 现代肿瘤医学, 2012, 20(9): 1844-1848.

9 高全立, 汪 萍. 小细胞肺癌干细胞样细胞的分离鉴定[J]. 中国癌症杂志, 2010, 20(6): 421-426.

10 孙艺华, 李 立, 潘 俊, 等. p53-/-, k-ras基因型小鼠肺癌细胞株的建立与鉴定[J]. 中国癌症杂志, 2009, 19(5): 335-339.

11 周清华. 肺癌新理论与新技术进展[M]. 第1版. 成都: 四川大学出版社, 2003: 31-65.

12 张 燕, 孙耕耘. 恶性胸腔积液的临床诊断及治疗进展[J/CD]. 中华肺部疾病杂志: 电子版, 2013, 6(1): 81-84.