负载丝裂霉素C的聚乳酸微球制备及对成纤维细胞生长抑制作用研究

朱继翔， 彭 晔， 田秀梅， 阳范文， 陈晓明

(广州医科大学基础学院生物医学工程系，广州 510182)

丝裂霉素C(MMC)是由头状链霉菌产生的抗生素混合物中分离提取的一种广谱抗肿瘤抗生素. 其作用原理是破坏DNA的结构和功能，抑制增殖期细胞脱氧核糖核酸(DNA)的复制，并抑制核糖核酸(RNA)的合成，从而有效地抑制细胞增殖[1]. 在青光眼手术治疗中，MMC主要应用于减少术后滤过泡的瘢痕化，提高手术的成功率[2]；在癌症临床治疗中，MMC主要应用于减少术后肿瘤细胞的增生[3]. 然而，MMC的代谢周期很短，临床上使用MMC抑制细胞增生时需要反复给药，给患者带来不便和痛苦. 对MMC控制释放体系的研究，有利于延长MMC的给药周期，减少患者痛苦，具有临床应用的前景. MMC通常可以采用壳聚糖、脂质体等作为药物载体[4-6]，主要的负载是薄膜、微球以及水凝胶[7-9]. 近年来，以合成类可降解高分子为载体的载药微球研究备受关注[10-12]，为药物的负载与缓释提供了重要参考. 利用微球化技术进行药物负载具有许多优势，它可以维持药物稳定性，延长药物缓释时间，有效对药物进行靶向控制释放，并且降低药物毒副作用等. 而生物可吸收类聚酯，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)以及他们的共聚物(PLGA)等，具有一定的生物相容性，无免疫原性，已被美国FDA批准作为体内植入材料应用于临床治疗. 利用生物可吸收类聚酯作为载体，负载药物进行控制释放已有相关报道[13-14]，在此基础上，本研究采用单乳化剂挥发法制备负载MMC的PLA微球，对其体外释放和对成纤维细胞生长的抑制作用进行研究，其结果对PLA载药微球体系的探索，对其它药物的负载与控制释放具有一定参考价值.

1 材料与方法

1.1 材料与培养

小鼠NIH-3T3成纤维细胞购于中山大学实验动物中心，采用含10%胎牛血清、0.1 mg/mL双抗的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，于37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养.

1.2 试剂和原料

聚乳酸(PDLLA)，相对分子量为5万，惠州华阳医疗器械有限公司；丝裂霉素C(MMC)，阿拉丁试剂公司；聚乙烯醇(PVA)，聚合度300～500，sigma公司；二氯甲烷，丙酮，分析纯，广州化学试剂厂.

1.3 PLA/MMC微球的制备

采用单乳化溶剂挥发法制备PLA载药微球，具体步骤如下：称取200 mg的PLA和一定量的MMC溶于10 mL二氯甲烷与丙酮的混合溶剂中(二氯甲烷与丙酮的体积比为4∶1),300 r/min搅拌下，将所得聚合物溶液缓慢注入100 mL质量分数为2%的PVA水溶液中，800 r/min下乳化10 min；将乳浊液倒入1 L蒸馏水中，1 000 r/min、25℃下溶剂挥发12 h后，将所得微球离心分离，蒸馏水清洗3次，除去微球表面残留的PVA；冷冻干燥(FD-1-50真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司)3 d，室温下干燥器中存储备用.

用同样的方法制备不含MMC的PLA空白微球干燥器中存储备用.

1.4 PLA/MMC微球性能测试

称取100 mg PLA/MMC微球溶于2 mL丙酮，加入10 mL乙醇，离心，取上清液于358 nm处测定紫外吸收，并结合MMC标准溶液的紫外吸收曲线计算载药微球中MMC的实际含量. 分别依照式(1)～(3)计算微球载药量、包封率及成球率.

载药量(%)=

实测负载的MMC质量/微球总质量×100%，

(1)

包封率(%)=

实测负载的MMC质量/加入的MMC总质量×100%，

(2)

成球率(%)=

实际获得的微球质量/投入的聚合物与药物的总质量×100%.

(3)

红外光谱分析：用Nicolet/Nexus670型傅里叶变换红外光谱仪测量原料PLA、MMC及载药微球的红外谱图.

SEM分析：取1滴微球悬浮液滴于铜台表面，自然晾干后喷金，通过扫描电镜(JSM-6380LA型，日本电子株式会社)观察微球的表面形貌.

粒径分析：采用激光粒度分析仪(MasterSizer 2000型)测量空白微球与载药微球的粒径，平行测量3次.

1.5 PLA/MMC微球的体外释放

称取20 mg载药微球装入透析袋，放入试管，加入10 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液(PBS)；将试管置于37℃恒温振荡器振荡释放；间隔一段时间取出2 mL溶液，同时补充2 mL新鲜PBS缓冲溶液；于358 nm处测定紫外吸收，并结合MMC标准曲线计算释放溶液中MMC的含量. 时间间隔为：1/4、1/2、1、2、3、5、7、10、14、18、21、25、28、31 d.

1.6 小鼠NIH-3T3成纤维细胞生长活力

将成纤维细胞接种于培养皿中，细胞密度近似于1.0×104/sample；实验组培养基中加入50 mg载药微球；药物对照组培养基中加入MMC，维持其质量浓度为0.5 mg/mL；空白对照组中加入未载药的空白微球. 用噻唑蓝(MTT)法检测细胞在第1小时、1 d、3 d的生长情况，用倒置显微镜(LEICA，德国)观察细胞的形态.

2 结果与讨论

2.1 微球制备参数的确定

载药微球的性能受众多制备参数的影响，其中，药物与聚合物的比例尤为重要[13]，它直接影响微球的实际载药量以及包封率. 当乳化剂质量分数为2%，药物与聚合物比在1/99～15/85时，载药微球的实际载药量、包封率、成球率以及微球直径的变化如表1所示. 微球的成球率皆达到90%左右，因为PLA具有较强的疏水性，在PVA溶液中乳化时较易成球. 当MMC投药比例的增加时，微球粒径变化不大，表明采用单乳化法制备疏水载药微球时，相对于乳化剂质量分数、搅拌速度等微球制备参数，药物浓度对微球粒径的影响较小. 另外，随着MMC投药比例的增加，微球的实际载药量有所增加，当投药比为10/90时，实际载药量最高达到5.43%，继续增加投药比，微球的载药量并没有明显提高，表明此时微球载药量达到饱和状态；当投药比为10/90时，微球的包封率达到最高，为49.1%. 结果表明，药物与聚合物的最佳投料比例为10/90.

表1 药物与聚合物的比例对微球载药的影响Table 1 Effects of different MMC/PLA ratios on the properties of microspheres

图1 MMC、PLA以及PLA/MMC载药微球的红外谱图

2.2 微球形貌观察

2组聚合物微球呈规整的球状，表面光滑，分布较均匀(图2)，有文献报道在油相中引入低沸点的溶剂可改善微球的形貌[14]，本研究中，在油相溶剂二氯甲烷中加入适当的丙酮，一方面可以增加药物MMC在油相溶剂中的溶解度，有利于提高包封率，另一方面也达到了改善微球形貌的目的. 另外，由SEM图片观察可知，药物MMC的负载对微球的形貌、粒径影响较小，2组微球形貌相似. 使用激光粒度仪测量空白微球与载药微球的粒径，分别为37.78±0.16 μm与44.81±0.24 μm.

2.3 微球体外释放研究

当药物与聚合物投料比为10/90，实际载药量为5.43%，包封率为49.1%时，载药微球的体外累计释放曲线如图3所示. 在释放初期，无明显暴释现象，微球累计释放药物31 d，累计释放量达到84.8%. 整个释放过程大致可分为3个阶段，在释放的前5 d内，释放速率相对较快，平均每天释放6.4%；在第7至25天内，释放速度均匀，达到平衡，平均每天约释放2.5%左右；在最后1周内，释放速率较缓慢，平均每天的释药量低于1%.

图2 显微观察微球(A，B)与载药微球(C，D)

Figure 2 The microexamination of blank microspheres (A, B) and MMC loaded microspheres (C, D)

图3 载药微球的累积释放曲线

Figure 3 Cumulative release of MMC by MMC loaded microspheres

微球中药物的释放主要通过2种方式，一种是药物经微球的孔隙扩散到介质中，而此时微球表面吸附的药物可能会发生突释现象；另一种是通过微球的降解，使得药物缓释. 微球的孔隙及微球的大小影响药物的释放[15]. 可以通过制备技术控制微球的孔隙尺寸，孔隙多的基质释药率要比孔隙少的高. 一般情况下，随着微球粒径的增加，释药率降低，因此，为了使微球的释放速率相对较稳定，微球的粒径应基本一致. 载药微球的降解受到多方面因素影响，包括制备微球聚合物的组成，亲疏水官能团的比例，以及聚合物本身的降解机制等[16]. 在较难降解的聚合物中引入共聚物单元，可以提高聚合物降解速率，从而提高微球的释放量与释放速率；在聚合物中引入亲水基团，增加聚合物的亲水性能，也有利于微球释放性能的提高.

选用具有良好生物相容性的聚乳酸制备载体微球，加入乳化剂PVA提高成球率，并采用丙酮与水的混合溶液溶解MMC，制备微球时，在油相中引入低沸点溶剂丙酮，有利于提高包封率. 在释放初期的0～5 d内，微球负载的药物量较高，少部分最外层药物通过微球的孔隙扩散到介质中，表现出相对较高的释放速率；在释放中期，即7～25 d，最外层药物的扩散达到平衡，药物主要通过微球降解而释放，此时，释放速率适中，并且维持较长时间的平衡，达到了缓释药物的目的；在释放后期的7 d里，由于载药量的减少，释放速率较为缓慢，使得累积释放量趋于平衡. 以PLA为载体负载MMC的微球，释药时间持久，速率均匀，累计释放量较高，无明显暴释现象，是较为理想的药物载体.

2.4 微球对小鼠NIH-3T3成纤维细胞增殖的抑制

为了进一步验证PLA/MMC微球的释放效果，在小鼠NIH-3T3成纤维细胞的培养环境中加入载药微球，并设置对照组，考察载药微球对细胞生长的影响. 用MTT法检测MMC处理的细胞在1 h、1 d、3 d的生长情况(图4). 随着培养时间的增加，载药微球组与直接加药组的OD值明显降低，表明2组对细胞的增殖起到了抑制作用，载药微球缓释的MMC有效抑制了细胞的增殖，培养至第3天时，载药微球组的细胞数量仅为培养板对照组的10%左右；而空白微球组与培养板对照组的OD值随着培养时间的增加而增高. 图5结果表明，0.5 mg/mL MMC培养环境下载药微球组对细胞生长的抑制作用明显.

图4 MTT法测试成纤维细胞的生长

图5 MMC对不同时间点成纤维细胞生长的影响

3 结论

采用单乳化溶剂挥发法成功制备了负载MMC的PLA微球. 当药物MMC与载体PLA的比例为10∶90时，微球的实际载药量与包封率最高，分别达到5.62%与49.1%；体外释放实验显示，载药微球可有效缓释MMC达30 d以上，累计释放量为84.8%；载药微球可以有效抑制小鼠NIH-3T3成纤维细胞的增殖. 本研究证明了PLA载药微球体系应用于控制释放MMC的可行性，对PLA载药微球体系的探索，也为其它药物的负载与控制释放提供了参考.

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