丛枝菌根真菌的钙调素基因在共生过程中的作用

熊珊珊　赵斌

摘要：通过对丛枝菌根真菌（Glomus intraradices）中分离得到的钙调素基因序列进行分析，并利用实时荧光定量PCR（Real time PCR）研究该基因在共生体形成早期不同时间段的差异表达，以及在菌根共生体形成后，经胁迫处理，观察钙调素基因的表达量变化。荧光定量PCR结果表明，丛枝菌根真菌在与植物的共生过程中，存在钙离子激增现象，表明钙调素基因在共生早期的钙离子信号转导方面具有调控作用，而且在菌根真菌共生早期的菌丝生长过程中钙调素的调控作用可能与肌球蛋白的辅助有关。

关键词：丛枝菌根真菌（Glomus intraradices）；钙调素基因；实时荧光定量PCR；菌丝生长

中图分类号：Q938.1；Q343.3+6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-3177-06

The Roles of Calmodulin Gene of Glomus intraradices in Symbiosis Process

XIONG Shan-shan，ZHAO Bin

（Key laboratory of Agricultural Microbiology/College of Life Science and Technology， Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： The differential expression of calmodulin gene obtained from Rhizophagus irregularis（Glomus intraradices） in different symbiosis stages was studied with real time PCR. The changes of calmodulin gene expression were observed by forcing treatments after the formation of mycorrhizal symbionts. The results showed that calmodulin gene had surge phenomenon during the process of symbiosis between Rhizophagus irregularis and the plant. The calmodulin gene regulated signal transduction in the early symbiotic of calcium. The calmodulin gene was rapidly detected in the environment stress and triggered a series of cascade reaction related with myosin.

Key words： （Glomus intraradices）； calmodulin gene； real time PCR； hypha growth

丛枝菌根真菌（Glomus intraradices）（AMF）是球囊菌门类真菌，定居于土壤中。90%以上的陆生植物的根系可与土壤中的真菌相互作用，其中大部分会与AMF建立内共生关系[1]。植物与AMF共生通过资源的传递来克服生物及非生物对自身的侵害[2]。宿主植物的根段在与AMF未直接接触的情况下就已经有了相互作用，植物的根分泌物中含有信号分子，可以诱导AMF菌丝生长及分支[3]。这些由寄主植物释放的特异性根分泌物质与非寄生植物分泌的物质不同，包含许多宿主信号物质，包括类黄酮（Flavonoids）和独脚金内酯（Strigolactones）[4]。

菌根真菌和植物都存在钙离子的激增（Ca2+ oscillations）现象，它是共生双方发生相互作用的标志。在共生早期AMF会释放一种信号因子与植物根分泌物中的信号物质相呼应，使钙离子浓度发生变化，从而引发一系列的级联反应[1]。然而，最先研究证明钙离子作为菌根信号传递物质的是在苜蓿植株的根毛中[1]。AMF的钙调素（Calmodulin，CaM）会接收钙离子的信号，从而激活下游共生基因的转录。但是其中的信号转导途径还有待研究。构巢曲霉中的CaM会沿着肌动蛋白丝聚集到菌丝顶端进行定位生长，这可能是在一种动力蛋白的帮助下完成的[5]，最近的研究报导动力蛋白中的一员肌球蛋白马达（Myosin motor），其重链上的异亮氨酸-谷氨酰胺结构（IQ motif）可以与结合了钙离子的钙调素结合，而菌根真菌中也发现存在动力蛋白typeⅠmyosin，它可能也参与了菌丝定位生长中CaM的调控作用[6]。

在污染的土壤中也有菌根存在，目前的研究认为接种AMF后可促进植物的生长，提高植株的生物量，对植株体内的有害物质起到稀释作用，从而缓解其毒害作用[7]。但是AMF是如何提高植物对有害物质的耐受性，以及是否会对宿主体内的代谢途径产生影响，而且Ca2+和H+同为转导化学信号和环境信号的指示物质[4]，其分子机制目前尚不清楚。

本试验旨在探讨丛枝菌根真菌中钙调素基因参与了共生早期的表达调控，研究其在共生早期钙离子信号途径中的作用，对进一步研究共生早期信号转导提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

丛枝菌根真菌的分离株为BEG141，新的物种名是Rhizophagus irregularis。

DNA和 RNA的提取：取样量约为0.1 g，休眠孢子RNA的抽提材料为保藏于4 ℃的AMF接种剂，将接种剂利用倾斜湿筛法过180目筛后，在体式显微镜下挑取约2 000个孢子用于抽提DNA和RNA。供试菌株宿主为紫花苜蓿（Medicago sativa）。

根样的收获：取盆栽植物根段清洗干净后，剪成0.5～1.0 cm长的小段，混匀，迅速置于液氮中。该过程尽可能短（约2 min内完成），处理后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 基因序列获取

抽提AMF基因组DNA[8]，根据已知的CaM部分片段[9]经反向PCR克隆获取5′端序列，RNA抽提后反转录，得到基因3′端序列的3′RACE克隆[10]。根据所发表的Glomus mosseae（G.m）中的Gm228[9] （它表达的马达蛋白为type I myosin）序列设计简并引物，获得片段序列，再进行TA克隆及测序分析[11]。

1.3 生物信息学分析

利用Prot Param tool（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）进行钙调素蛋白的理化性质分析，推测AMF中的CaM氨基酸序列。利用NCBI的蛋白质序列数据库（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列的同源性比对，找到其中已正式发表的具有代表性物种的CaM序列。

1.4 共生前期试验材料的获取

用于抽提RNA的不同生长阶段AMF材料的获取：休眠期孢子，取 4 ℃保存的接种剂，利用湿筛法筛选干净的休眠孢子；萌发的孢子，挑取表面灭菌[12]后的孢子置于含根分泌物[12]的灭菌水中，暗培养3～5 d，待孢子萌发管长度达到3～5 mm时收获，同时以不含根分泌物为负对照；盆栽试验，用AMF孢子侵染紫花苜蓿，根据AMF的侵染状况收获不同共生时期AMF侵染的根段，分为附着胞形成时期、根内菌丝生长期、丛枝形成期和泡囊期。

1.5 胁迫试验

将接种的苜蓿进行不同胁迫处理。重金属胁迫：以锌（ZnSO4）和镉（CdCl2）进行处理；盐胁迫：以NaCl溶液及类金属砷（Na3AsO4）对盆栽植物进行处理。

ZnSO4处理：浓度为100、200 mg/kg（以土壤中的Zn含量计算）。从植株长出第一片真叶开始，分3 d 3次浇ZnSO4溶液，植株在含锌环境下生长4周为长期处理，短期处理则是3周后检测AMF侵染率≥80%后，浇入200 mg/kg的ZnSO4溶液，在第0.5、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0、168.0 h取样，共7次，3次重复。对照（CK）为种植3周后浇同样水量的蒸馏水，0.5 h取样的植株。

NaCl处理：浓度为0.8、1.2 g/kg（以NaCl在土壤中的含量计算），长期处理使用0.8 g/kg浓度处理，短期处理使用1.2 g/kg的胁迫浓度处理，方法与Zn胁迫相同。

CdCl2处理：60 mg/kg CdCl2进行4周的长期处理，90 mg/kg CdCl2进行短期处理，处理方法与ZnSO4胁迫相同。

Na3AsO4处理：60 mg/kg Na3AsO4进行4周的长期处理，120 mg/kg Na3AsO4进行短期处理，处理方法与Zn相同。

除此之外，对未萌发孢子转录水平变化进行了比对（材料为对照组菌根）。

1.6 实时荧光定量PCR引物的设计及基因转录量的分析

根据钙调素基因的ORF区段设计特异性引物RT258F1/RT258R1，肌球蛋白基因片段序列设计特异性引物myoF/myoR。用荧光定量PCR检测CaM基因和myosin基因 mRNA的转录情况，内参基因选用Gi 18sRNA，内参引物为ALO/S112[13]。反转录后，取0.5 μL模板，用特异性引物RT258F1/RT258R1、myoF/myoR进行反转录效果的检测；同时，利用基因的内含子区段引物201F/201spR2进行36个循环反应，对反转录产物进行DNA污染的验证，无扩增条带则为合格的cDNA样品，用于进行实时荧光定量PCR分析。将cDNA进行5倍梯度稀释，筛选最佳的模板加入量。

实时荧光定量PCR反应体系：上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO公司）10 μL，反转录产物 （cDNA第一链）2 μL，补蒸馏水到20 μL。利用Applied Biosystems step oneTM Real-Time PCR system Thermal cycling（ABI 7300）荧光定量PCR仪进行反应。扩增程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；之后加溶解曲线分析反应。结果分析采用2-△△ct的计算方法。

2 结果与分析

2.1 钙调蛋白序列

结合反向PCR与3′RACE技术的结果，可从基因组DNA及cDNA上同时获取较为完整的序列信息，将所得的序列信息使用生物软件ClustalW程序进行序列分析，所在编码区从起始密码子ATG到终止密码子TAG的cDNA长度为450 bp，ORF为762 bp，包含4个外显子和4个内含子，而ATG前的启动子和5′端非翻译区的片段长度为433 bp，所得到的整个序列的G+C含量为30.87%，符合丛枝菌根真菌的基因组碱基G+C低含量的特点[14]。将丛枝菌根真菌所表达的钙调素蛋白氨基酸序列与有代表性的其他物种所表达的钙调素蛋白氨基酸序列进行同源比对，相似度为90.34%（图1）。

通过已知的ORF，可按照标准的密码子利用表获得AMF的蛋白质序列，共149个氨基酸组成，预测其分子量大小为 17 kDa，等电点为4.18，并根据同源性比对找出其两端的保守区域，钙调素基因所表达的蛋白质两端具有可与钙离子结合的区域——EFhand超家族。

在蛋白质结构预测系统[Protein structure prediction server，（PS）2-v2）]上对钙调素基因的编码蛋白质进行同源建模模拟，得到其三维结构如图2所示。所预测的蛋白质三维结构符合公认的钙调蛋白质的三维结构特点。

2.2 实时荧光定量PCR

2.2.1 丛枝菌根真菌不同时期的生长状况 经过统计，丛枝菌根真菌孢子萌发状态良好，真菌孢子的萌发率均为70%，而在无菌水中的真菌孢子则没有萌发，可用于后续试验。前期预试验是将侵染的紫花苜蓿根段经TB染色制片后进行显微镜观察，通过统计侵染率、各时间段特定结构（如附着胞、丛枝、泡囊）的数量，确定在合适时间进行后续试验的侵染根段取样，用于研究不同时期丛枝菌根真菌CaM的表达量变化。通过镜检观察不同时期的侵染状况（图3）：从第5天开始进行抽样观察，第10天开始出现附着胞，第12天侵染点增至30%且有菌丝贯穿于根细胞内，第18天开始出现丛枝，直至第25天会有大量丛枝产生，到50 d后有泡囊形成。2.2.2 不同共生时期的盆栽试验结果 根据丛枝菌根真菌对紫花苜蓿的侵染状况，收获12、18、25、50 d的根样品提取RNA，经反转录后用于实时荧光定量PCR检测。挑取消毒处理的丛枝菌根真菌孢子放入根分泌物中进行萌发生长，2周后收获并提取RNA反转录成cDNA，并进行半定量的电泳检测。结果发现，相较于休眠期孢子，萌发的丛枝菌根真菌CaM有明显的上升表达，而肌球蛋白（Myosin）的上升表达更为明显，可进行荧光定量分析。

丛枝菌根真菌CaM的荧光定量结果（图4a）表明，与休眠孢子比较，该基因在共生早期，从孢子萌发开始有明显的上调表达，这说明丛枝菌根真菌CaM蛋白质在侵染早期的功能较为显著；12 d时表达量达到最高，但随着侵染的深入逐渐降低。证明钙离子和钙调蛋白质主要是在菌根真菌与宿主植物共生早期的信号转导上起作用。

丛枝菌根真菌肌球蛋白的荧光定量结果（图4b）表明，在菌丝生长过程中，丛枝菌根真菌Myosin表达量增加最为明显；在菌根真菌侵染紫花苜蓿形成共生体后该基因表达量明显下降，但是随着真菌菌丝在植物细胞中的延伸其表达量逐渐增高；之后由于侵染的深入、丛枝分化以及内生菌丝的生长均需要肌球蛋白来延伸AMF的细胞骨架，从而促进其生长，故呈持续递增趋势；50 d时，产生大量根外菌丝，丛枝菌根真菌肌球蛋白表达量增长更为明显。肌球蛋白在菌根真菌与宿主植物的共生过程中呈梯度增长模式，这可能是因为肌球蛋白在菌丝生长过程中协助钙调素定位在生长的活性部位。

2.2.3 共生体中丛枝菌根真菌CaM在不同胁迫处理下的转录变化 丛枝菌根真菌CaM在胁迫处理下的转录变化结果（图5）表明，CaM对于细胞外环境刺激下的应激效应很迅速。当加入过多量的钠盐时，24.0 h丛枝菌根真菌CaM表达量与对照相比上升了1.75倍；在加入镉离子后，CaM表达量在3.0 h后有上升表达，比对照高1.75倍；加入锌离子后6.0 h，CaM表达量是对照的1.6倍；加入砷酸盐后，与对照相比，CaM表达量有2次明显的上升表达，分别是1.5 h和12.0 h，其中1.5 h时CaM的表达量升高较明显。以上4种胁迫处理的结果表明，菌根共生体中菌根真菌的钙调素在砷酸盐、镉离子和钠盐的高渗胁迫下作用较为明显，推断可能存在钙离子的信号转导过程。

3 讨论

3.1 丛枝菌根真菌中钙调素基因的功能

本研究中从AMF中克隆到CaM基因序列，与其他物种进行比对后，发现不同物种间钙调素无论在基因序列、氨基酸序列还是功能上都是高度保守的，但是不同种属间又有其特异性[15]。钙调素对于细胞适应环境变化具有重要的调控作用，在一些真菌细胞中钙调素的一些功能是保守的，但是也存在差异性，因为钙离子信号转导途径会通过钙调蛋白在不同宿主细胞内所表现的不一样的功能来适应不同的环境[6]。病原真菌在面对环境压力时，CaM会首先激活下游的钙调素相关激酶（由CMK1和CMK2共同编码）和磷酸酶（Calcineurin）[7]。

AMF中的钙调素对于共生前期的信号转导、早期的共生建立以及细胞适应环境变化都具有重要的调控作用。由不同时期的荧光定量分析可以看出，钙调素的功能主要体现在共生早期阶段，对于孢子萌发及共生建立有重要的指示作用，当AMF接收植物分泌的信号物质，会在真菌细胞内产生钙离子激增现象，而钙离子浓度的变化会被钙调素识别，并激活下游的共生相关基因的表达。不同胁迫条件下的CaM表达量差异分析则表明细胞要适应外界的环境压力，也需要钙离子和钙调素的共同参与。

钙离子和氢离子作为转导化学信号和环境信号的指示物质[4]，并将信号转导给钙调素后的分子机制仍有待研究。

3.2 丛枝菌根真菌中钙调蛋白与肌球蛋白间的功能联系

对丝状真菌中钙调素的研究证明，钙离子对菌丝顶端生长具有促进及引导的作用，而钙调素作为钙离子的主要受体是这一系列变化的枢纽，从丛枝菌根真菌中分离得到的钙调素基因与丝状真菌的钙调素基因在序列结构上有高度的同源性，从而推断钙调素在引导菌根真菌菌丝极性生长从而促进共生中有着重要的作用。本研究中丛枝菌根真菌萌发后CaM有明显的上调表达，也可证明这一点。肌球马达蛋白（Myosin motor）可以沿着肌动蛋白运输细胞器，其中肌球蛋白Ⅰ型（Myosin 5α）为钙离子依赖型，它的活性受重链尾部的调控。研究证明，肌球蛋白Ⅰ型在微摩尔浓度的钙离子的刺激下，它的重链上的异亮氨酸-谷氨酰胺基序（IQ motif）会与CaM结合，这表明钙离子和CaM是以此来调控肌球蛋白的功能[16]。而丛枝菌根真菌中获得的动力蛋白typeⅠmyosin基因，在萌发过程中有非常明显的上调表达，这很可能是因为在菌丝生长过程中肌球蛋白协助钙调素定位在其活性部位，之后肌球蛋白基因的表达量下降，直至共生建立后菌丝在根内延生，其表达量才开始逐渐回升。

在关于轮藻（Chara）的肌球蛋白研究中也发现CaM可能是作为肌球蛋白的一条轻链存在，因为当钙离子与CaM结合后，不仅可以激活肌球蛋白的能动性以及肌动蛋白依赖型ATPase的活性，还可与肌球蛋白的重链结合[17]。在酿酒酵母中CaM对极性生长过程也具有重要的调控作用，它会与一种肌球蛋白V型（Myo2p）相互作用行使这一功能[5]。在体外，Myo2p所包含的IQ结构位点可与CaM结合，而不需要钙离子的参与，在细胞周期中Myo2p和CaM可能是结合共定位[18]。肌球蛋白沿着肌动蛋白运输线粒体、分泌囊泡和液泡。在丛枝菌根真菌菌丝的萌发生长过程中，也会发现线粒体会聚集在菌丝的活性生长部位，这可能也是在肌球蛋白的参与下进行的[19]。

综上所述，钙离子对菌丝顶端生长中具有促进及引导作用；在菌根真菌中，钙调素接收钙离子的信号后引导真菌的菌丝极性生长、参与钙离子的信号转导从而促进共生；在抗逆性的研究中发现，钙调素可能参与了细胞抵抗高渗环境下的钙离子信号转导途径。对于今后研究菌根共生早期钙离子信号转导及砷胁迫下的细胞抗逆性机制有一定的指导作用。

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综上所述，钙离子对菌丝顶端生长中具有促进及引导作用；在菌根真菌中，钙调素接收钙离子的信号后引导真菌的菌丝极性生长、参与钙离子的信号转导从而促进共生；在抗逆性的研究中发现，钙调素可能参与了细胞抵抗高渗环境下的钙离子信号转导途径。对于今后研究菌根共生早期钙离子信号转导及砷胁迫下的细胞抗逆性机制有一定的指导作用。

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综上所述，钙离子对菌丝顶端生长中具有促进及引导作用；在菌根真菌中，钙调素接收钙离子的信号后引导真菌的菌丝极性生长、参与钙离子的信号转导从而促进共生；在抗逆性的研究中发现，钙调素可能参与了细胞抵抗高渗环境下的钙离子信号转导途径。对于今后研究菌根共生早期钙离子信号转导及砷胁迫下的细胞抗逆性机制有一定的指导作用。

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