硒对马铃薯试管苗生长和GSH-PX活性的影响

朱云芬，向极钎，殷红清，程 群，徐 怡

(1.恩施州农业科学院，湖北 恩施 445002；2.恩施州硒应用技术与产品开发研究院，湖北 恩施 445002)

硒对马铃薯试管苗生长和GSH-PX活性的影响

朱云芬1,2，向极钎1,2，殷红清1,2，程 群1，徐 怡1

(1.恩施州农业科学院，湖北 恩施 445002；2.恩施州硒应用技术与产品开发研究院，湖北 恩施 445002)

以MS为基本培养基，以鄂马铃薯5号脱毒试管苗为试验材料，研究不同浓度亚硒酸钠(Na2SeO3)溶液对马铃薯试管苗生长和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性的影响.结果表明：Na2SeO3质量体积分数为5 mg/L时，马铃薯试管苗的长势较好，GSH-PX活性相对较高，Na2SeO3质量体积分数高于5 mg/L时，对GSH-PX活性及组培苗的生长有不同程度的抑制作用，到40 mg/L时生长完全受到抑制，基本停止生长，表明只有适当的硒浓度才能增强GSH-PX活性，促进生长.

硒；马铃薯；试管苗；谷胱甘肽过氧化物酶；酶活力

硒(Se)是地球上的一种稀少的元素，是人和动物体内的必需微量元素之一，直接参与机体重要的抗氧化酶-谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)的组成，硒的生物学作用主要是通过硒蛋白发挥作用.从硒的生物学作用来看，目前比较确定的功能主要有：抗氧化、防衰老；增强免疫；保证精子的活力；预防肿瘤；参与激素的代谢；防治克山病、大骨节病；预防血管疾病如动脉粥样硬化；抗病毒；拮抗重金属离子的毒性等.人体缺硒会造成癌症、心血管疾病、白内障、高血压、甲状腺肿大、免疫缺失、关节炎等40多种威胁人类健康的疾病，被誉为“生命的火种”、“抗癌之王”、“心脏的守护神”等.

全世界有40多个国家和地区属于缺硒地区.我国是一个缺硒大国，从东北三省起斜穿至云贵高原，占我国国土面积的72%地区存在一条低硒地带，其中30%为严重缺硒地区，华北、东北、西北等大中城市都属于缺硒地区[1].营养学专家经过反复实验得出，人体中血硒的含量标准值为0.10 mg/kg，低于此值就会发生缺硒症[2].而我国有29%地区人均含硒量在0.02 mg/kg以下，定为极度缺硒地区，有43%的地区人体含硒值在0.03～0.04 mg/kg之间，为缺硒地区[3].中国营养学会推荐的成年人摄硒量为50～250 mg/d，人体中硒主要从日常饮食中获得，食物中硒的含量直接影响了人们日常硒的摄入量.因此，开发利用富硒产品已成为当前的一项迫切任务.

马铃薯(SolariumtuberosumL)属茄科茄属，具有丰富的营养，适应性强，产量高，产业链长，是一种粮、菜、饲料及工业原料兼用型高产高效作物.马铃薯是世界第四大粮食作物，其种植面积和产量仅次于小麦、水稻和玉米.据统计，目前我国马铃薯的栽培面积约在500万hm2以上，占世界的1/4，总产量在8 500万t左右，占世界的1/5，我国已成为世界上马铃薯种植面积最大的国家[4]，马铃薯在我国国民经济增长中占有重要地位.

在农业生产中把硒肥作为微肥施用是增产和改善农产品品质的一项重要措施.国内已经在水稻等多种蔬菜上做了大量的富硒研究，现在已经证明，喷施硒肥均可以有效提高其产量和含硒量, 有研究发现在一定的硒肥喷施浓度和喷施时期下，马铃薯的块茎产量和含硒量均有显著提高[5]，但硒对马铃薯组培苗生长及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性影响还未见报道.本研究旨在探索硒对马铃薯组培苗生长发育及其GSH-Px活性的影响，以提出合理的马铃薯施硒技术，促进马铃薯的生长发育，提高马铃薯的抗逆性，为进一步开发利用富硒马铃薯提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物材料为鄂马铃薯5号脱毒试管苗，由恩施州农业科学院马铃薯研究所提供.

表1 亚硒酸钠不同处理对马铃薯脱毒试管苗表型性状的影响Tab.1 Influence of different treatment of Na2SeO3 on potato plantlets in vitro phenotypic traits

1.2 试验方法

1.2.1 材料培养 筛选生长较一致的脱毒试管苗，将其剪切成带一个腋芽、长约1 cm的茎段，接种到培养基上进行亚硒酸钠的单因子试验.以MS为基本培养基，亚硒酸钠的浓度设置为0、5、10、20、30、40 mg/L，培养基中均加入6 g/L琼脂，80 g/L蔗糖，pH调为5.8～6.0，配制后高压灭菌20 min.在每支试管内接种3个茎段，每个处理设3次重复，每重复10支.培养条件为：工作时间16h/d，光照强度2 000 lx，温度(22±2)℃.

1.2.2 生长发育指标测定 接种后的第30 d，从每个处理随机抽取3支试管，调查茎长、茎粗、叶片、根数、根长等表型性状，计算平均值，重复3次.

1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶活性测定 GSH-Px的测定参照李合生的间接法II，根据GSH与5,5’-二硫代对二硝基苯甲酸(DTNB)反应生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子，在423 nm处有最大吸光值，计算该离子的浓度，即可计算出GSH减少的量，测出GSH-Px的活性.

取马铃薯试管苗0.5 g于预冷的研钵中，加入0.2 mol/L磷酸缓冲液(含1 mmol/L EDTA-Na2，5%的水溶性PVP，pH6.2)10 mL，冰浴中研磨成匀浆，4 000 r/min离心10 min，取上清液于12 000 r/min离心5 min，取上清液供酶活力测定用.取上述酶液各0.4 mL，分别注于酶管和非酶管中，并将非酶管加热使酶失活，分别加入1.0 mmol/L GSH 0.4 mL和经37℃预热的1.5 mmol/L H2O20.2mL，立即于37℃下反应3 min，再在2支试管中加入1.67%的偏磷酸沉淀液4.0 mL，2 000r/min离心10 min,保留上清液.另取2支试管分别加入上述清液2.0 mL，再取1支试管加双蒸水0.4 mL和1.67%的偏磷酸沉淀液1.6 mL作为空白管，并在这3支试管中各加入0.32 mol/L Na2HPO42.5 mL和DTNB 0.5 mL，反应5 min，在412 nm下比色读取OD值.酶活性单位为μ/(g·min).酶活计算公式为：植物GSH-PX活力(U/mL)=([GSH]酶管-[GSH]非酶管)/(A×反应时间×酶反应液的体积×植株质量)，其中A为标准曲线的斜率.酶活力定义:1 mL反应液中，37℃每分钟催化1μ mol GSH氧化的酶量为一个酶活力单位.

2 结果与分析

2.1 Na2SeO3不同浓度处理对马铃薯试管苗生长的影响

马铃薯组培苗茎段在对照和低浓度的Na2SeO3培养基上培养，在6～7 d全部萌芽，当其浓度大于10 mg/L时，萌芽时间推迟4～7 d左右.由表1显示，试管苗生长30 d时，在5 mg/L硒处理条件下，除茎粗外，组培苗的茎长，根数、根长和叶片数均高于对照，这表明添加适当浓度的硒盐能促进试管苗的生长.而在添加Na2SeO310～40 mg/L浓度范围内，试管苗的生长情况随浓度的变化有显著的差异，随着Na2SeO3浓度的增加, 茎长逐渐变小、茎粗变细、根数变少、根长变小、叶片数变少，叶片呈黄绿色，长势变弱，有明显的抑制作用，直至40 mg/L硒盐处理时马铃薯试管苗生长完全受到抑制，基本停止生长.

图1 马铃薯不同处理条件下GSH-Px的酶活比较

2.2 Na2SeO3不同浓度处理对马铃薯试管苗GSH-Px活性的影响

用Na2SeO3处理马铃薯试管苗30 d时，如图1所示，与0 mg/L对照相比，马铃薯试管苗GSH-PX活力在5 mg/L硒处理时增长最快，达到130 μ/(g·min)，比对照增加了80.6%.而随着Na2SeO3浓度的继续增大，GSH-Px活力则呈下降趋势，10～30 mg/L Na2SeO3浓度处理时，其GSH-Px活力均高于对照，当浓度达到40 mg/L时， GSH-Px活力低至50 μ/(g·min)，低于对照，这可能是由于随着Na2SeO3处理浓度的变大， 过高浓度的硒对有机体产生了毒性，反而抑制了GSH-Px活性.

3 小结与讨论

分析硒盐胁迫有关的马铃薯组培苗生长及GSH-Px酶活性的结果显示：Na2SeO3浓度为5 mg/L时，马铃薯组培苗的生长势较好，GSH-Px活性相对较高，Na2SeO3浓度高于5 mg/L时 ，对GSH-Px活性及组培苗的生长有不同程度的抑制作用，到40 mg/L时生长完全受到抑制，基本停止生长，表明只有适当的硒浓度才能增强GSH-Px活性，促进生长.

谷胱甘肽过氧化物酶( Glutathione peroxidase,GSH-Px) 是Mills等[6]1957年首次从牛红细胞中发现的，1973年Rotruck等[7]证明GSH-Px为含硒酶.至1985年Drotar等[8]才在植物组织中检测到GSH-Px的活性.近年来，从衣藻和高等植物中也分离得到类似硒代半胱氨酸残基的GSH-Px基因[9-10].Fu等[11]以衣藻为材料并利用分子生物学和生物化学技术研究了编码GSH-Px基因的UGA终止密码子处同样存在一个硒代半胱氨酸，这与报道的动物含硒GSH-Px有较大的相似性.植物体内的GSH-Px可能由多种家族成员组成，其家族成员可能在进化的不同时期以及不同的胁迫被招募来控制不同的发育途径和防御反应.从现有的研究结果来看，不同的环境胁迫(如病原菌侵染、高盐和重金属等)下，表达GSH-Px的mRNA水平将稳步提高[12]，暗示了GSH-Px在增加植物抗性以及耐胁迫方面具有重要作用.郭静成等[13]研究硒对高等植物中谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响，发现微量元素硒对高等植物中GSH-Px 活性影响是非常明显的，并推测高等植物中存在活跃的GSH-Px，在一定硒浓度范围内，硒对该酶活性增加有明显的促进作用，超过一定硒浓度则酶活力下降，而且植物生长也受到抑制，这种现象可能与硒的毒害有关，这与本试验的结果也是一致的，也为进一步研究植物的硒积累水平及耐受硒胁迫的机制奠定了基础.

[1]原中共中央地方病防领导小组办公室和中国科学院环境科学委员会.中华人民共和国地方疾病与环境因素图集[M].北京：科学出版社,1989.

[2]杨光圻.人的硒需要量研究[J].中国地方病学杂志，1989(5):298.

[3]环境与地方病组.克山病与自然环境和硒营养背景[J].营养学报，1982,4(3):175-182.

[4]陈伊里,屈冬玉.马铃薯产业与冬作农业[M].哈尔滨，哈尔滨工程大学出版社,2006:1-35.

[5]黄景新,秦听.硒肥对马铃薯块茎产量及含硒量的影响[J].马铃薯杂志,1999，13(2):94-95.

[7]Rotruck J T,Pope A L,Ganther H E,et al.Biochemical role as a component of glutathione peroxidase[J].Science,1973,179:588-590.

[6]Mills G C,Hemoglobin catabolism,I.Glutethione peroxidase,an erythrocyte emzyme uchich protects hemoglobin from oxidative breakdoun[J].J Biol Chem,1957,229(1):189-197.

[8]Drotar A,Phelps A,Fall R.Evidence for Glutathione Peroxidase Activity In CμLtured Plant Cells[J].Plant Science,1985,42:35-40.

[9]Yokota A,Shigeoka S,Onishi T,et al.Selenium as inducer of glutathione peroxidase in low-CO2grown Chlamydomonas reinhardtii[J].Plant Physiology,1988,86:649-651.

[10]Shigeoka S,Takeda T, Hanaoka T.Characterization and immunological properties of seleniumcontaining glutathione peroxidase induced byselenite in Chlamydomonas reinhardtii[J].Biochemical Journal,1991,275:623-627.

[11]Fu LH,Wang XF,Eyal Y, et al.A selenoprotein in the plant kingdom[J].Journal of Biological Chemistry,2002,277:25983-25991.

[12]苗雨晨,白玲,苗琛,等.植物谷胱甘肽过氧化物酶研究进展[J].植物学通报,2005,22(3):350-356.

[13]郭静成,尹顺平.硒对高等植物中谷胱甘肽过氧化物酶活性及谷胱甘肽含量的影响[J].西北植物学报,1998,18(4):533-537.

责任编辑：高山

EffectofSeleniumonPotatoPlantletsGrowthandGSH-PXActivity

ZHU Yun-fen1,2，XIANG Ji-qian1,2，YING Hong-qing1,2，CHENG Qun1,2，XU Yi1,2

(1.Enshi Academy of Agricultural Sciences，Enshi 445002，China；2. Enshi Selenium Institute of Applied Technology and Product Development，Enshi 445002，China)

Using MS as the basic medium and virus-free plantlets of E-malingshu 5 as the experimental materials,we research the effect of different Na2SeO3concentration on the growth of potato plantlets in vitro and the influence of glutathione peroxidase activity. The results showed that when Na2SeO3concentration was 5mg/L plantlets grew well and GSH-PX activity is relatively high，when the Na2SeO3concentration is higher than 5 mg/L，had inhibition effect in different degree on the growth of the plantlets and the activity of GSH-PX，the growth was completely inhibited when concentrations reached 40 mg/L，and the plantlets basically stopped growing,which showed that only the appropriate concentration can enhance the GSH-PX activity and promote growing.

Selenium; potato;plantlet; glutathione peroxidase; enzyme activity

2013-12-16.

湖北省农业科技创新中心基金项目(2010NKY028).

朱云芬(1982- )，女，硕士，农艺师，主要从事植物组织培养及分子生物学研究.

Q946

A

1008-8423(2014)01-0024-03