炙甘草汤对脐静脉内皮细胞分泌转化生长因子与G-CSF的影响

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(成都中医药大学，成都 610075)

炙甘草汤对脐静脉内皮细胞分泌转化生长因子与G-CSF的影响

马鹏，张泽渊，刘渊*

(成都中医药大学，成都 610075)

目的 研究炙甘草汤对转化生长因子(TGF-β1)与G-CSF分泌的影响。方法 选取炙甘草汤与右归饮2个方剂,脐静脉内皮细胞设空白对照组、炙甘草汤组、右归饮组及混合组，每组分别加入相应中药液，于培养第3，6，9天收集细胞培养上清液，ELISA检测上清液中TGF-β1与G-CSF的分泌水平。结果 TGF-β1分泌水平：给药组均明显刺激脐静脉内皮细胞产生TGF-β1，与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.001)。实验初期(第3,6天)炙甘草汤刺激效果较强，实验后期(第9天)混合给药组表现出更好的刺激效果。G-CSF分泌水平：给药组均明显刺激脐静脉内皮细胞产生G-CSF，与空白对照组相比，P<0.001。混合给药组刺激效果最明显，其次为炙甘草汤组。给药后细胞因子分泌均随时间延长而增加。结论 炙甘草汤能增强细胞TGF-β1与G-CSF的分泌，当有右归饮辅助时这种效应更加明显，其刺激增强作用有时间累积效应，随时间延长TGF-β1与G-CSF的分泌增多。

炙甘草汤;右归饮;脐静脉内皮细胞;转化生长因子(TGF-β1);G-CSF

炙甘草汤是《伤寒论》中阴阳并补的代表方。当前对炙甘草汤多局限于抗心律失常的研究，并将该方作为抗心律失常的专方[1]。炙甘草汤以人参、炙甘草、大枣补益心气；以桂枝、生姜、清酒温通心阳；以生地黄、麦冬、麻仁滋心阴；以阿胶补心血。从整体结构看，该方是一首补心气、温心阳、滋心阴、养心血而四补心之气、阳、阴、血的平补方[2]。但从方中各药用量深入分析，则知主要是以重滋阴血为特点。中医认为“心主血脉”，心通过“化赤”等作用参与血生成，清代名医唐宗海把炙甘草汤作为心参与生血的代表方，临床上也不乏通过中药加强血生成的报道。现代医学研究认为血管内皮细胞直接与血液接触，可通过多种细胞途径参与血细胞发生增殖，凝血，炎性细胞迁移等多种生理或病理过程。本研究以炙甘草汤为主方，同时添加右归饮作为辅助方剂，在体外环境下刺激脐静脉内皮细胞，研究炙甘草汤对血液生成的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株 脐静脉内皮细胞株EA.hy926购于中科院上海细胞库。

1.2 药物与试剂 炙甘草汤：炙甘草、桂枝、人参、生地黄、麦门冬、麻仁、大枣、生姜、阿胶；右归饮：熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、甘草、杜仲、肉桂、制附子，所有中药均购自北京同仁堂。中药煎煮后进行过滤除渣、高温灭菌，每1 mL药液含生药0.2 g。

DMEM培养基(GIBCO),FBS(GIBCO),谷氨酰胺(GIBCO)，六孔培养板(Corning),0.25% Trypsin-EDTA(GIBCO)，TGF-β1 ELISA试剂盒(达科为)，G-CSF ELISA试剂盒(CUSABIO)。

1.3 实验分组 细胞分为空白对照组(只加基本培养基，不加中药液)、右归饮组、炙甘草汤组及混合组(添加炙甘草汤与右归饮)，每组样本数为10。培养第3,6,9天收取细胞培养上清液，1 000 r/min，离心15 min，后分装-20 ℃保存。

1.4 ELISA检测 1)TGF-β1检测：实验前将各试剂放至室温平衡30 min，将样品置于80 ℃水浴8 min进行活化，取出后冷却5 min，计算样品孔及标准品孔数，100 μL/孔在相应孔中加入待测样品及标准品，摇匀，封膜后于室温孵育2 h,吸弃孔内液体，每孔加入生物素标记抗体工作液100 μL,室温孵育2 h，弃去孔内液体，洗板3次，每孔加入辣根过氧化物酶亲和素标记工作液100 μL，室温孵育30 min，洗板，加入显色液，显色终止后酶标仪读取450 nm处OD值。2)G-CSF检测:实验前将各试剂放至室温平衡30 min，计算样品孔及标准品孔数，100 μL/孔在相应孔中加入待测样品及标准品，摇匀，封膜后于37 ℃孵育2 h，吸弃孔内液体，每孔加入生物素标记抗体工作液100 μL，37 ℃孵育1 h，弃去孔内液体，洗板3次，每孔加入辣根过氧化物酶亲和素标记工作液100 μL，37 ℃孵育1 h,洗板，加入显色液，显色终止后酶标仪读取450 nm处OD值。

2 结果

2.1 炙甘草汤、右归饮刺激脐静脉内皮细胞分泌TGF-β1 实验第3，6，9天,细胞培养上清中TGF-β1的表达水平在3个给药组中均明显高于对照组，见表1，P<0.01，表明3个给药组均明显刺激脐静脉内皮细胞产生TGF-β1。在3个给药组之间,在第3，6天组间差异有统计学意义，而在第9天差异不明显,具体表现为炙甘草汤单独作用时对脐静脉内皮细胞的刺激作用更加明显，与混合给药时相比，P<0.05，差异有统计学意义;炙甘草汤组与右归饮组差异不明显。第9天虽各给药组之间差异不明显,但混合给药组TGF-β1的表达量由最初较低水平发展为略高于另外2个给药组水平。

组 别第3天第6天第9天对照组 227．7±3．7 257．7±2．6 274．4±6．1 右归饮加炙甘草汤组508．5±30．5## 730．4±4．7## 1554．9±10．4##右归饮组 593．8±10．3## 934．6±33．9## 1506．9±34．3##炙甘草汤组 691．5±42．9##△1268．5±41．3##△1447．6±3．4##

注：与对照组比较，##P<0.001；与混合给药组比较，△P<0.05

2.2 炙甘草汤、右归饮刺激脐静脉内皮细胞分泌G-CSF 实验整个过程中在空白对照组中均未检测到G-CSF的表达，而在实验过程中随着时间的增加，在3个给药组中均检测到增加的G-CSF表达，见表2。在第3天3个给药组之间G-CSF表达，P<0.01，差异无统计学意义；第6天混合给药组G-CSF水平明显高于另外2个单独给药组，单独给药组之间差异无统计学意义；第9天混合给药组G-CSF水平明显高于单独给药组，P<0.01；炙甘草汤组与右归饮组之间差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 中药方剂对G-CSF表达水平的影响 ng/mL

注：与对照组比较，##P<0.01；与混合给药组比较，△△P<0.01

3 讨论

转化生长因子β1(TGF-β1)是转化生长因子家族的重要成员,因其能在表皮生长因子存在的条件下刺激成纤维细胞发生表型转化而得名。TGF-β1具有促进细胞生长、分化、迁移、免疫调节和细胞外间质形成等作用。大量研究[3]结果表明，TGF-β1在体内肿瘤、遗传性毛细血管扩张性出血症、纤维化性疾病、动脉粥样硬化等疾病过程中都起着重要的作用，因而近年来越来越受到关注。TGF-β1对细胞的增殖具有正负双向重调节作用。在体外能够抑制较原始的造血祖细胞从静止期进入增殖循环，而且这种作用是可逆的[4]。近年来研究[5]显示，在体外扩增培养中加入30～300 pg/mL的TGF-β1能够明显的上调原始造血干、祖细胞表面标记CD34,促进造血祖细胞的增殖和维持。

G-CSF作为粒细胞集落刺激因子广泛用于粒细胞减少和粒细胞缺乏的病人，G-CSF主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化,重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化,其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。G-CSF还具有促进BM中造血干祖细胞进入PB和免疫调节作用，现广泛用于HSCT中造血干细胞动员。在allo-HSCT中，G-CSF能改变T细胞亚群，促使T细胞向Th2细胞极化[6]，促进Treg细胞的增殖[7]，增加移植物中DC细胞数量[8]。

综合文献报道，2种细胞因子在造血相关疾病中发挥重要作用，本实验重在探讨中药方剂对2种细胞因子的刺激作用以验证中药方剂在造血疾病中的治疗作用。实验发现在TGF-β1分泌方面,2种中药单独或混合作用均能明显刺激脐静脉内皮细胞产生TGF-β1细胞因子，在实验初期炙甘草汤单独作用时刺激效果更加明显，随着时间延长混合给药组刺激作用凸显，细胞因子的表达水平超过单独给药组，并且在3种给药组中随着时间延长细胞因子分泌量增加，说明长期用药时2种中药混合作用效果更佳，若短期服用可单独服用炙甘草汤中药。在G-CSF分泌方面，空白对照组未检测到G-CSF的分泌,3个给药组能明显检测到G-CSF的分泌，并且也表现出随时间延长而分泌增加的现象，在实验初期(第3天)各给药组能检测到G-CSF分泌，给药组之间无统计学意义；至第6,9天，检测发现混合给药组G-CSF因子水平明显高于2个单独给药组，说明混合给药组对G-CSF的刺激更加强烈，在临床实践中,可混合服用以增强疗效。综合2种细胞因子的实验结果，炙甘草汤中药方剂能明显刺激生血作用,当有右归饮辅助作用时效果更强，混合给药长时间治疗会更加有利于药效发挥且能达到更好治疗效果。

[1]王爱明.炙甘草汤治疗心律失常的临床思路[J].吉林中医药,2007,27(7):9-10.

[2]齐方洲,朱慧芳,徐辽寅,等.炙甘草汤新论[J].吉林中医药,2009,29(9):811-812.

[3]李红.TGF-β1对原代培养猪甲状腺细胞TPO表达的影响[J].中国医学工程,2011,19(1):17-20.

[4]Grzegorzewski K,Ruscetti F W,Usui N,et al.Recombinant transforming growth factor beta 1 and beta 2 protect mice from acutely lethal doses of 5-fluorouracil and doxorubicin[J].The Journal of experimental medicine,1994,180(3):1047-1057.

[5]Batard P,Monier M N,Fortunel N,et al.TGF-(beta) 1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation[J].Journal of Cell Science,2000,113(3):383-390.

[6]Mielcarek M,Graf L,Johnson G,et al.Production of interleukin-10 by granulocyte colony-stimulating factor-mobilized blood products:a mechanism for monocyte-mediated suppression of T-cell proliferation[J].Blood,1998,92(1):215-222.

[7]Rutella S,Lemoli R M.Regulatory T cells and tolerogenic dendritic cells:from basic biology to clinical applications[J].Immunol Lett,2004,94(1/2):11-26.

[8]Arpinati M,Green C L,Heimfeld S,et al.Granulocyte-colony stimulating factor mobilizes T helper 2-inducing dendritic cells[J].Blood,2000,95(8):2484-2490.

EffectofPreparedLicoriceDecoctiononTGF-β1andG-CSFproductionofumbilicalveinendothelialcells

MA Peng,ZHANG Zeyuan,LIU Yuan*

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China)

ObjectiveTo investigate the effect ofPreparedLicoriceDecoctionon TGF-β1 and G-CSF production of umbilical vein endothelial cells.MethodsTwo different Chinese herbal medicine prescriptions were used in this research.Umbilical vein endothelial cells were divided into four groups (control group,prepared licorice decoction group,youguiyin group and mixed group).The cell culture supernatant was collected at the 3 rd,6 th,9 th day after herb liquor added into the cell culture system.TGF-β1 and G-CSF level were detected by ELISA.Results1)TGF-β1 production:The TGF-β1 level was higher in all three herb liquor groups than that of control group (P<0.001).The TGF-β1 level ofPreparedLicoriceDecoctiongroup was highest than that of other groups at day 3 and day 6,but the TGF-β1 level was highest in mixed group than that of the other at day 9.2)G-CSF production:The level of G-CSF was higher in all three herb liquor groups than that of control group (P<0.001).The level of G-CSF in mixed group was highest,and then is the level in prepared licorice decoction group.ConclusionThePreparedLicoriceDecoctionn could stimulate umbilical vein endothelial cells secrete higher level of TGF-β1 and G-CSF than control group,and the stimulatory effect was stronger when mixed with youguiyin.The level of TGF-β1 and G-CSF were growing higher as time goes on.

PreparedLicoriceDecoction;Yougui yin;umbilical vein endothelial cell;TGF-β1;G-CSF

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.010

国家自然科学基金资助：基于“心主血脉”研究炙甘草汤诱导内皮细胞参与造血的机制(81072728)。

马 鹏(1980-)，男，硕士研究生。研究方向：历代名医治疗难治性血液病的临床思维及经验研究。

] 刘 渊，男，教授，电话：15528044471，电子信箱：liuy60s@sina.com。

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