卵巢上皮性癌中Livin蛋白的表达及临床意义

曹 璐，秦 瑞，刘俊宝

(吉林大学中日联谊医院 妇产科，吉林 长春130033)

Livin(KIAP/ML2IAP)基因是近来新发现的抑制凋亡蛋白家族(IAPs,inhibitors of Apoptosis protein)的成员，其在肿瘤组织中特异性高表达的特点使之成为研究的热点，目前的研究也表明，此特点有可能为肿瘤的早期诊断、基因治疗和细胞治疗提供新靶点[1,2]。它可以选择性的与胱天蛋白酶结合并且抑制其活性，特别是对caspase-3、-7、-9活性的抑制，从而起到阻断凋亡受体的作用[3-5]。本实验应用免疫组织化学法检测Livin蛋白在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织及卵巢上皮性癌中的表达，以期在卵巢癌的诊治中起到一定的指导意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取吉林大学中日联谊医院2008年1月-2009年10月间手术切除的组织标本，其中正常卵巢组织20例、卵巢良性上皮性肿瘤组织20例和卵巢上皮性癌组织60例。患者的病例病理资料完整，年龄在35-77岁之间，平均年龄45岁，所有患者术前都没有进行放、化疗和各种激素治疗，也没有合并其他任何系统的恶性肿瘤。卵巢上皮癌标本根据国际妇产科联盟(FIGO,International Federation of Gynecology and Obstetrics)标准进行临床分期和病理组织学分级。其中Ⅰ、Ⅱ期共30例，Ⅲ、Ⅳ期共30例，高分化组(G1)16例，中分化组(G2)12例，低分化组(G3)32例，按组织学分型浆液性囊腺癌 25例， 粘液性囊腺癌25例，子宫内膜样癌10 例。

1.2 方法

Livin兔抗人单克隆抗体(浓缩型)购于北京博奥森生物技术有限公司，Livin抗体工作浓度为1∶100。多聚HRP/AP免疫组化检测试剂盒、DAB显色液均购自北京中杉金桥生物制品有限公司。具体操作按试剂盒说明书严格进行，以PBS 代替一抗设立阴性空白对照。

1.3 结果判定

每张切片均在双盲下进行判定，阳性表达为镜下组织细胞结构清晰，在细胞胞浆内出现黄色或棕黄色颗粒，且染色明显高于背景。根据免疫组化评分方法对阳性细胞着色强度记分，然后在高倍镜下连续计数1000个细胞，对阳性细胞所占百分比进行评分，根据两者结果进行分析，取两者评分之乘积，结果>3分为阳性，0-3分判为阴性。

1.4 统计方法

显著性检验采用χ2检验，当T<1或n<40 采用精确概率法，求P值。所有数据统计都在SPSS17.0软件上进行。

2 结果

2.1 正常卵巢组织中、卵巢良性肿瘤组织、卵巢上皮癌中Livin蛋白的表达

Livin蛋白阳性颗粒呈棕黄色，主要在细胞质中表达，偶见于细胞核内，其在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织中的表达率呈现逐渐递增的趋势，依次为5.0%、15.0%、65.0%，可见卵巢上皮癌组织中Livin的表达明显高于正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织，三者之间的阳性表达率比较差异非常显著，有统计学意义(χ2=30.03，P<0.05)。卵巢上皮癌组织和正常卵巢组织中Livin的表达有明显差异(χ2=21.60，P<0.05)；同时和卵巢良性肿瘤组织中Livin的表达相比亦有明显差异(χ2=15.07，P<0.05)；而正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织中Livin的表达无明显统计学意义(χ2=0.28，P>0.05)。详见表1，图1-图2。

表1 Livin蛋白在不同卵巢组织中的表达

图1Livin在浆液性囊腺癌中的阳性表达(SP×400)图2Livin在卵巢子宫内膜样癌中阳性表达(SP×400)

2.2 Livin蛋白的阳性表达与卵巢上皮癌临床病理特征的关系

Livin蛋白在卵巢上皮性癌高分化组中的阳性表达率为43.8%，中分化组的阳性表达率为50.0%，低分化组中表达率为81.3%，三组之间进行比较，χ2=8.08，P<0.05，Livin的表达存在明显统计学差异。可见Livin的阳性表达率随着组织病理学分级的升高而逐渐增加。

在手术病理分期中Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ期阳性表达率分别为56.7%、73.3%，二者比较差异不显著，无明显统计学意义(χ2=1.83，P>0.05)。

在浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宫内膜样癌中阳性表达率依次为68.0%、60.0%、70.0%，Livin的表达在不同组织学类型中无明显差异，无统计学意义(χ2=0.48，P>0.05)。见表2。

表2 Livin蛋白的阳性表达与卵巢上皮癌临床病理特征的关系

3 讨论

卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统常见三大恶性肿瘤之一，其中卵巢上皮性恶性肿瘤占卵巢恶性肿瘤的85%-90%。由于卵巢癌缺乏特异性早期发病指标，缺乏有效的早期诊断以及可靠的筛查方法，使其早期诊断率低，70%以上的患者发现时已属晚期，5年生存率仅为25%-30%。且近年来，卵巢恶性肿瘤在我国发病率呈上升趋势，趋向于年轻化，已经成为严重威胁妇女生命的恶性肿瘤。细胞凋亡受阻在肿瘤的发生、发展中起着重要作用，所以对细胞凋亡基因的研究成为了热点。

本实验通过在20例正常卵巢组织中检测Livin蛋白发现仅有1例呈低表达，其余均无表达，这与国内的研究发现[6，7]Livin蛋白在正常成人的大多数终末组织中(除胎盘)低表达或者不表达的结论是一致的。Vucic等[8]检测到在肺癌、黑色素瘤、直肠癌及结肠癌中Livin呈现阳性表达。Yagihashi等[6]用PT-PCR检测发现Livin在结肠癌细胞系和胰腺癌细胞系中都呈过度表达。另外又用ELISA方法检测35名胃肠道肿瘤病人血清中的抗Livin抗体，发现其在胃肠道肿瘤中的阳性率比抗survivin抗体的阳性率都高[9]。本研究通过免疫组化法检测出Livin在卵巢上皮性癌中阳性表达率亦高达65%，由此推断Livin可能成为一个新的肿瘤抗原。Livin在卵巢上皮性癌组织中的表达显著高于正常卵巢组织及卵巢良性上皮性肿瘤，并与后两者之间存在明显的统计学差异，由此推测Livin蛋白的高表达在卵巢上皮性癌的发病过程中可能发挥了重要作用。

Gazzaniga等[10]对30例膀胱癌病人进行Livin基因表达水平检测后随访，发现Livin呈阴性组的病例比阳性组复发间隔时间显著延长(27.5个月，2.5个月)，从而推测Livin的表达可能与肿瘤的复发存在某种相关性。在本研究中，Livin蛋白在卵巢上皮性癌高分化组、中分化组、低分化组中的表达存在着显著性差异，其表达强度随着组织病理学分级逐渐升高而增强，预示着肿瘤更具有侵袭性和不良的预后，并且卵巢癌的组织分级是一判断预后的独立因素，因此Livin可以作为判断肿瘤恶性程度及预后的指标，Livin在卵巢上皮性癌中的高表达可能预示着该肿瘤恶性程度高，预后差，易复发。

Kasof[11]认为Livin的细胞内分布与Survivin相似，即既在胞质内表达，也在胞核内表达，而本研究通过免疫组化方法，检测出Livin主要在胞质内表达，偶见于胞核中。Kasof等[11]还通过实验证明了Livin mRNA表达减少可促使caspase活性增加及肿瘤细胞凋亡，提示了以Livin作为靶点治疗肿瘤的可能。Mertens等[12]发现用siRNA技术以Livin为靶点治疗肿瘤的可行性。IAPs家族是抑制细胞凋亡的重要蛋白之一，Livin作为该家族的新成员，特异性高表达于多种人类恶性肿瘤中，对其深入研究对肿瘤的发生、发展和治疗、预防都有重要意义，而目前对于Livin在卵巢上皮性癌中的研究有限，尚需进一步加深研究。

参考文献：

[1]蔡 明,王国斌,陶凯雄等.Livin靶向siRNA对大肠癌细胞凋亡的诱导作用[J].中华肿瘤防治杂志,2010,17(12):890.

[2]Crnkovic-Mertens I,Bulkescher J,Mensger C,et al.Isolation of peptides blocking the function of anti-apoptotic livin protein[J].Cell Mol Life Sci，2010,67(11):1895.

[3]Liu Chuan,Wu Xiaohou,Luo Chunli，et al.Antisense oligonucleotide targeting Livin induces apoptosis of human bladder cancer cell via a mechanism involving capase3[J].J Exp Clin Cancer Res.2010,29(3):63.

[4]Li Wen-Qi,Li Xiao-Lin,Wang Guang-Ping，et al.Gene expression of livin and surviving in adult patients with acute lymphoblastic lerkemia and its clinical significance[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi.2011,19(4):921.

[5]程永贵,封韬,王晓庆.Livin蛋白在肾细胞癌中的表达及其与预后的关系[J].肿瘤学杂,2012,18(3):217.

[6]Yagihashi A,Asanuma K,Tsuji N,et al.Detection of anti-Livin anti-body in gastrointestinal cancer patients[J].Clin Chem,2003,49(7):1206.

[7]Tanabe H,Yagihashi A,Tsuji N,et al.Exp ression of survivin mRNA and livin mRNA in non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2004,46(3):299.

[8]Vucic D,Stennicke HR,Pisabarro MT,et al.ML-IAP,a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expre- ssed in human melanomas[J].Curr Biol,2000,10(11):1359.

[9]Yagihashi A,Asanuma K.Nakamura M,et al.Detection of anti-survivin antibody in Gastrointestinal cancer patients[J]．Clin Chem,2001,47;1729.

[10]Gazzaniga P,Gradilone A,Giuliani L,et al.Expression and prognostic significance of livin,survivin and other apoptosis related genes in the progression of superficial bladder cancer [J].Ann Oncol,2003,14(1):85.

[11]Kasof GM,Gomes BC.Livin,a novel inhibitor of apoptosis protein family member [J].J Biological Chemistry,2001,276(5):3238.

[12]Mertens IC,Seyler FH,Butz K.Induction of apoptosis in tumor cells by siRNA-mediated silencing of the Livin/ ML-IAP/KIAP gene[J].Oncogene,2004(22):8330.