维血宁的HPLC指纹图谱研究

曹 瑞，程茜菲，李艳茸，何 瑞，曹林林(.陕西中医学院，咸阳 7046；.陕西中医学院制药厂，咸阳 7083)

维血宁收录于《中国药典》中[1]，由虎杖、鸡血藤、炒白芍、熟地黄、生地黄、墨旱莲、仙鹤草、太子参八味药组成，滋阴凉血，清热凉血，作为临床上常用的治疗血小板、白细胞减少症的复方中药，其不良反应小、治疗效果好，善于预防，长于治本，而且还可以作为一种补血健身剂。目前，文献报道大多是测定维血宁中虎杖苷、大黄素[2-4]、芍药苷[5]的含量，未有对其指纹图谱研究的报道。本文采用高效液相色谱法，以虎杖苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷为对照品，建立了维血宁的指纹图谱[6]，为维血宁的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 超声清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号SB-3200D，180 W，40 kHz)；HC.TPII.S普通药物天平(济南市医疗器械厂)；电子分析天平(瑞士萨多利斯)；高效液相色谱仪(Waters2695-2996)，Empower色谱工作站；梅特勒GB204电子天平(万分之一)。

1.2 试药 虎杖苷(中国药品生物制品检定所，批号111575-200502)；大黄素甲醚(中国药品生物制品检定所，批号758-9904)；大黄素(中国药品生物制品检定所，批号0756-9505)；大黄素-8-O-β-D葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷(由本实验室自制，质量分数>98.3%)；维血宁(由陕西中医学院制药厂提供，批号111001，110702，110801，110802，110901，110902，110903，111002，111201，111202)。色谱乙腈、甲醇(Fisher公司)；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Accurasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长：280 nm；进样量：10 μL；分析时间：90 min。流动相：A(乙腈)-B(1 mL·L-1磷酸水)梯度洗脱，洗脱梯度0～12 min(98%B)、12～30 min(98%～80%B)、30～35 min(80%～75%B)、35～40 min(75%～73%B)、50～60 min(65%～52%B)、 60～70 min(52%～10%B)、70～75 min(10%B)、75～83 min(10%～97%B)。

2.2 溶液的制备 供试品溶液的制备：精密量取样品2.0 mL，转移至25 mL量瓶中，用体积分数80%甲醇定容，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。

混合对照品溶液的制备：精密称取各对照品适量，加甲醇分别制成每毫升含虎杖苷0.036 mg、大黄素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷0.055 mg、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷0.193 mg、大黄素甲醚0.094 mg、大黄素0.107 mg的溶液，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验 取同一供试品溶液，按2. 1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以虎杖苷为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，结果表明，5个共有峰相对保留时间RSD为0.018%～0.06%，相对峰面积RSD为0.23%～0.65%，RSD均小于3%，表明仪器的精密度良好。

2.3.2 稳定性实验 取2.2项下供试品溶液，分别于0，2，4，8，12和24 h进样10 μL进行分析。以虎杖苷为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，结果相对保留时间的RSD为0.02%～1.78%，相对峰面积的RSD为 0.033%～1.15%，RSD均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.3 重复性实验 取同一批号样品(111001)，分别精密称取6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以虎杖苷为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，结果表明，相对保留时间RSD为0.023%～1.79%，相对峰面积RSD为0.50%～1.14%，RSD均小于3%，说明该方法重复性良好。

2.3.4 回收率实验 精密吸取6份已知含量的维血宁(批号：111101)2.0 mL，分别精密加入虎杖苷溶液0.439 mg、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷0.361 mg，大黄素甲醚0.214 mg、大黄素0.322 mg和大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷0.54 mg，按2.1项下的色谱条件进行测定，计算回收率、RSD值，结果见表1。

表1 回收率实验结果

2.4 指纹图谱的建立和相似度分析

2.4.1 指纹图谱的建立及共有峰的标定 取10批维血宁(批号111001，110702，110801，110802，110901，110902，110903，111002，111201，111202)，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进行HPLC分析，建立指纹图谱。通过应用同样的色谱条件，进行了对照品的分析，通过对比对照品和样品的HPLC色谱图和紫外光谱图；并通过色谱图中的保留时间，最终确认1号峰为虎杖苷所对应的峰，2号峰为大黄素-8-O-β-D葡萄糖苷所对应的峰，3号峰为大黄素所对应的峰，4号峰为大黄素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷所对应的峰，5号峰为大黄素甲醚所对应的峰。

色谱图见图1。

图1 10批维血宁样品的指纹图谱

2.4.2 共有峰的相对峰面积和相对保留时间 比较10批样品的HPLC色谱图，共标定5个特征峰(图1)，选取1号峰作为参照峰，保留时间与峰面积为1，计算其他各峰的相对保留时间及相对峰面积，结果5个共有峰相对保留时间RSD为0.06%～0.1%，各批号共有峰保留时间基本一致；5个共有峰相对峰面积RSD值均小于3%，说明各批号维血宁成分含量均一、稳定。

2.4.3 对照指纹图谱 10批维血宁经《国家药典》的中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算生成其对照指纹图谱，结果见图2。

图2 对照指纹图谱

2.4.4 相似度计算 将10批维血宁指纹图谱数据导入国家药典委员会的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版) ”设定匹配模板，进行谱峰自动匹配，生成对照指纹图谱，进行相似度评价，相似度分别为:0.979，0.971，0.973，0.996，0.993，0.991，0.973，0.984，0.989和0.989。表明10批样品与对照指纹图谱相似度良好，对照图谱可作为维血宁的指纹图谱。

3 讨论

经采用全波长扫描，结果280 nm谱峰数目较多，各色谱峰的表观丰度适中，同时比较了甲醇-水、乙腈-水以及乙腈-磷酸水系统，结果表明乙腈-1 mL·L-1磷酸水系统各色谱峰峰形好，分离效果最佳。结果采用乙腈-1 mL·L-1磷酸水为流动相，280 nm为测定波长。

本文通过HPLC测定10批维血宁，建立了维血宁的指纹图谱，并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”评价10 批维血宁的指纹图谱整体相似度，结果10批样品指纹图谱的相似度均大于0.97。共指认了5 个化学成分，分别为虎杖苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷。本文所建立的HPLC指纹图谱可指导维血宁“谱-效”的构建，也为维血宁质量评价提供依据。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中国药典2010年版[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010:1141.

[2] 李建忠，朱文学.维血宁颗粒的质量标准研究[J].中国药业，2005:14(5)，41-42.

[3] 杨怀武，王碧辉.维血宁颗粒(无糖型)的质量标准[J].中国药师，2010，10(13):1528-1529.

[4] 顾峥嵘，承晨.HPLC法测定维血宁颗粒中大黄素的含量[J].江苏药学与临床研究，2005，4(13):27-29.

[5] 朱洪敏，金艺，李晶，等.RP-HPLC法同时测定维血宁颗粒中芍药苷、虎杖苷、麦角甾苷和白藜芦醇的含量[J].药物分析杂志，2009，29(6):905-908.

[6] 赵颖，李文，李鹏，等.鼠曲草饮片的RP-HPLC指纹图谱研究[J].中国药房，2013，15(24)：1392-1393.