高效液相色谱法测定草龙中没食子酸的含量

周小雅，梁光毅，刘雪梅(.广西卫生职业技术学院，南宁 530023；2.广西梧州市桂康药业有限公司，梧州 543000，3.广西中医药大学，南宁 530022)

草龙为广西壮族民间常用中草药，为柳叶菜科植物线叶丁香蓼(Ludwigiahyssopifolia(G. Don)Exell)的干燥全草，具有清热解毒、祛腐生肌功效，用于治疗感冒、咽喉肿痛、疮疥等[1]。民间使用已证明该药有较显著的疗效，具有很好的应用价值。但因缺乏专属性的化学对照品，草龙的质量控制研究方面的报道还是空白，阻碍了草龙药材的临床应用。

有文献报道，对草龙的化学成分和抑菌的药理作用进行系统研究[2]。药理研究表明，从乙酸乙酯部位分得的单体没食子酸有较好抑菌作用[3]。因此，本实验以没食子酸为指标成分，采用TLC建立了没食子酸的薄层鉴别方法，并用高效液相色谱法检测草龙中没食子酸含量，为草龙药材的制剂开发和质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 752N紫外可见分光光度计(上海分析仪器厂)；LC210高效液相色谱仪(上海分析仪器厂)。

1.2 试药 没食子酸(购于中国药品生物制品检定所，批号110831-200803：)；乙腈(色谱纯)；0.5mL·L-1磷酸溶液；草龙采于广西南宁地区，经广西中医学院中药研究所刘寿养副教授鉴定为柳叶菜科丁香蓼属植物线叶丁香蓼(Ludwigiahyssopifolia(G. Don)Exell)的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 没食子酸的薄层检识

2.1.1 对照品溶液的制备 取没食子酸对照品约2 mg，加适量甲醇溶解，摇匀，作为对照品溶液。

2.1.2 样品溶液的制备 取草龙粗粉约1 g，置于50 mL量瓶中，加入甲醇25 mL，超声提取30 min，放冷，摇匀，滤过，取滤液10 mL于水浴上浓缩至约1 mL，即得。

2.1.3 没食子酸的薄层鉴定 照薄层色谱法实验，吸取上述对照品和样品溶液适量，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(3∶5.4∶0.6)为展开剂，薄层板置展开缸中预饱和30 min，展开，取出，晾干，喷以50 g·L-1的磷钼酸，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，证明草龙药材中含有没食子酸。

2.2 没食子酸含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.5 mL·L-1磷酸(5∶95)；流速:1.00 mL·min-1；检测波长为270 nm；柱温：28 ℃。理论板数按没食子酸计算应不少于2 000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取没食子酸对照品约8 mg，精密称定，加甲醇溶解，并定溶至10 mL量瓶中，作为对照品溶液，质量浓度为0.80 mg·mL-1。

2.2.3 供试品溶液的制备 取草龙药材粗粉约1 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，精密加入蒸馏水25 mL，称定质量，超声提取(功率250 W，频率50 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用蒸馏水补足损失的质量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.2.4 线性关系考察 在2.2.1项下色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液0.5，1.0，2.0，2.5和3.0 μL进行测定，以对照品进样量(μg)为横坐标、对应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=2 388.1X+25.797(r=0.999 9)，结果表明，没食子酸进样量在0.4～2.4 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.5 精密度实验 精密吸取对照品溶液2 μL(0.80 mg·mL-1)，注入液相色谱仪，连续进样5次，测定峰面积，平均值3 852.55，RSD为0.98%(n=5)，表明精密度良好。

2.2.6 稳定性实验 将供试品溶液常温保存，分别在0，4，8，16和24 h精密吸取5 μL，注入高效液相色谱仪中进行测定。结果没食子酸含量分别为3.14，3.04，3.07，3.06和3.16 mg·g-1，平均含量为3.09 mg·g-1，RSD为2.08%(n=5)。说明供试品在24 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性实验 取同一批草龙药材，按2.2.3项下的方法制备5份供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，结果没食子酸含量分别为3.14，3.10，3.11，3.02和3.06 mg·g-1，平均含量为3.09 mg·g-1，RSD为1.51%(n=5)。

2.2.8 加样回收率实验 取已知含量的草龙药材粗粉0.5 g，共6份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入没食子酸对照品适量，按供试品溶液制备方法制备，按2.2.1项下色谱条件测定含量，计算加样回收率。结果见表1。平均回收率为98.36%，RSD为2.28%。

表1 回收率实验结果

2.2.9 样品测定 取3份草龙药材粗粉各1 g，精密称定，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，滤过，分别取续滤液5 μL进样，用峰面积按外标法计算，没食子酸的平均含量为3.15 mg·g-1，RSD为2.95%(n=3)。色谱图见图1。

图1 HPLC图

3 讨论

已有文献报道，用高效液相色谱法测定没食子酸的含量[4]，使用的流动相系统比较多[5-7]。本实验通过比较，以水、甲醇作为溶剂和超声提取的测定结果，最终选择以水作为溶剂，采用超声提取法制备草龙供试品，以乙腈-磷酸水溶液、水-二甲基甲酰胺-冰醋酸、乙腈-水为流动相进行分离。实验结果表明，以乙腈-0.5 mL·L-1磷酸水溶液(5∶95) 为流动相，测定草龙中的没食子酸的含量，分离效果较好，保留时间适宜。

本实验所采用方法快速、准确、灵敏度高、重复性好，对草龙的质量进行了薄层鉴别和含量测定，对草龙药材的品质评价和质量控制具有指导意义。

参考文献：

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第二分册：第53卷[M].北京：科学出版社，2000：35.

[2] 韦建华，卢汝梅，周媛媛.草龙化学成分的研究[J]. 时珍国医国药，2011，22(2)：319-321.

[3] 韦建华，卢汝梅，周媛媛.草龙提取物及化学成分的抗菌活性研究[J]. 时珍国医国药，2011，22(6)：1449-1450.

[4] 汗克孜·吐尔逊，迪力努尔·艾合买提.HPLC法测定血宁安吉把尔糖浆没食子酸含量[J].西北药学杂志，2013，28(1)：38-39.

[5] 尹海波，何静，王冰，等. 东北8种老鹤草没食子酸含量比较[J]. 中药材，2007，30(6):637-638.

[6] 张静，刘文翔，韩艳婷，等.HPLC法测定银黄口服液中绿原酸、黄芩苷和木犀草苷的含量[J].西北药学杂志，2011，26(4)：237-239.

[7] 何依玲，李晓誉.高效液相色谱法测定铁苋菜中没食子酸含量[J]. 中国药业，2007，16(11):18-19.