参花胶囊的HPLC指纹图谱研究及4种成分含量测定

肖会敏，何 悦，党 珍，谢艳华，王四旺(第四军医大学药学院新药研究中心，西安 710032)

参花胶囊由红花、丹参、菊花等中药组成，主要用于活血化瘀、行气止痛等。处方中主要活性成分有：丹参中的丹参酮类、丹酚酸类[1-3]，川芎中的川芎嗪、阿魏酸等[4]，红花中的红花黄色素、羟基红花黄色素A等[5-6]，赤芍中的单萜及单萜苷类化合物、苷类等[7]，菊花中的黄酮类化合物和绿原酸等[8]，山楂中的黄酮类、黄烷及其聚合物类、三萜类和有机酸类等[9]，甘草主要活性成分含有多种黄酮类化合物、三萜类化合物以及香豆素类、氨基酸、多种生物碱和多种有机酸等[10-11]。本处方采用醇提与水提等工艺制成。为表征本处方中的主要活性成分，作者采用高效液相色谱(HPLC)法对该制剂进行分析，参照文献方法[12]进行实验；同时，对参花胶囊中的4种成分即绿原酸、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、丹酚酸B进行定量分析。

1 仪器与试药

1.1仪器 岛津高效液相色谱仪，型号Prominence UFLC，配LC-20AD双泵，SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-20ACHT自动进样器，CTO-20A柱温箱，LC/Labsoluion色谱工作站(日本岛津公司)；BSA124S电子分析天平(德国赛多利斯公司)；KQ-300DE数控超声波发生器(昆山超声仪器有限公司)。

1.2试药 乙腈、甲醇，色谱级(美国Fish公司)；超纯水，由美国Millipore纯水仪制备(美国millipore公司)；丹酚酸B、迷迭香酸、绿原酸、羟基红花黄色素A对照品均购自中国药品生物制品检定研究院；参花胶囊(批号20090908，20090918，20090928，20130601，20130602，20130603，20130604，20130605，20130606，20130607)，第四军医大学药物研究所研制。

2 指纹图谱测定方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-5.0 g·L-1磷酸水溶液溶液(B)，梯度洗脱：0～15 min，A 5%→21%；15～40 min，A 21%→40%；40～65 min，A40%→100%；65～70 min，A100%。记录时间为70 min 。体积流量：0.8 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：254 nm；进样量5 μL。

2.2供试品与参比物溶液的制备

2.2.1参比物溶液的制备 精密称取迷迭香酸对照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中，加体积分数70%甲醇至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.1 mg·mL-1的参比物溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取10粒本品内容物，混匀，称取0.5 g，精密称定，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇适量，超声30 min，放冷，加体积分数70%甲醇至刻度，滤过(0.45 μm滤膜)，取续滤液作为供试品溶液。

2.3方法学考察

2.3.1精密度实验 取供试品溶液(批号20090908)，连续进样6次，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析。结果，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值分别小于0.5%和2.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2稳定性实验 取供试品溶液(批号20090908)，分别于各时间点即0，2，4，8，12和24 h进样，分析共有峰的相对保留时间、相对峰面积。结果，各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD值分别小于1.0%和2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3重复性实验 取6份样品(批号20090908)，分别按供试品溶液的制备与色谱条件进行分析，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析。结果，各共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD值分别小于0.5%和2.0%，表明重复性良好。

2.3.4指纹图谱的建立及相似度评价 取10批样品，分别按上述供试品溶液的制备方法制备样品溶液，进样，得色谱图(图1)，峰17为迷迭香酸即参比物，按上述色谱条件进行分析，建立指纹图谱。10批样品共有色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD值均分别小于0.5%和2.0%，符合文献[10]要求，见图1和图2。运用文献[10]要求对各批样品的指纹图谱进行相似度分析，对选定39个共有色谱峰进行谱峰匹配，通过计算得出样品指纹图谱的共有模式，并以此共有模式为标准，进行整体相似度评价，结果相似度为0.966～0.998，表明这各批样品的化学成分一致性较好。

图1 参花胶囊HPLC指纹图谱

图2 10批参花胶囊的HPLC指纹图谱

3 含量测定方法与结果

3.1色谱条件 检测波长为320 nm，其余同2.1项。

3.2对照品溶液的配制 分别精密称取绿原酸对照品2.2 mg、迷迭香酸3.8 mg、羟基红花色素A12.3 mg、丹酚酸B17.1 mg，置于10 mL量瓶中，加体积分数70%甲醇至刻度，作为储备液。

3.3供试品溶液的制备 同2.2.2项。

3.4线性关系 分别精密量取储备液0.031，0.062，0.125，0.250和0.500 mL对照品溶液，分别置于1 mL量瓶中，并加体积分数70%甲醇稀释至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，进样。以各对照品的质量浓度(x，μg·mL-1)为横坐标、峰面积值(y)为纵坐标，通过计算，得线性方程，结果见表1，表明各对照品在相应质量浓度范围内线性关系良好。

3.5精密度实验 精密吸取上述线性对照品溶液(0.125 mL储备液加体积分数70%甲醇定容至1 mL)，重复进样5次，测得绿原酸、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、丹酚酸B的相对标准差(RSD)分别为1.05%，1.07%，1.25%，1.09%和1.36%，表明仪器具有良好的精密度。

表1 对照品的线性方程及其质量浓度范围

3.6重复性实验 精密称取5份样品(批号20090908)，分别按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按3.3项下色谱条件进样测定。结果，绿原酸、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、丹酚酸B平均含量分别为0.55，3.20，0.99和8.50 mg·g-1，RSD值分别为1.33%，1.05%，1.15%和1.42%，表明该方法具有良好重复性。

3.7稳定性实验 精密吸取对照品溶液(0.125 mL储备液，加体积分数70%甲醇定容至1 mL)，在第0，2，4，8，12和24 h进样。结果，绿原酸、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面积的RSD值分别为1.08%，1.14%，1.19%和1.33%，表明该溶液在24 h内稳定。

3.8加样回收率实验 取参花胶囊(批号20090908，其中绿原酸、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、丹酚酸B分别为0.55，3.20，0.99和8.50 mg·g-1)10粒内容物，混匀，称取粉末0.5 g，精密称定，分别添加混合对照品溶液(分别精密称取绿原酸对照品1.0 mg、迷迭香2.5 mg、羟基红花色素A 8.0 mg，丹酚酸B 8.4 mg，置于5 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度)0.25 mL或0.50 mL或1.00 mL，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，共制备6份样品，按照3.1项下色谱条件进样测定。结果见表2，表明该方法回收率良好。

表2 加样回收率测定结果

表2(续) 加样回收率测定结果

3.9含量测定 精密称取10批样品，分别按照2.2.2项下方法制备供试品，按照3.1项下色谱条件测定。各批样品中绿原酸、羟基红花黄色素A、迷迭香酸 、丹酚酸B的平均含量分别为0.54，3.22，0.99和8.52 mg·g-1，RSD分别为1.37%，0.77%，1.40%和0.44%。

4 分析与讨论

中药尤其是复方中药，其功效是建立在多种复杂化学成分共同作用基础之上的，不能简单地以一种或几种成分来评价中药的有效性和专属性。中药的有效成分多数是次生代谢物，它们有很大的差异，同时具有一定的共性，很多成分出现在多种药材中，这对中药材的真伪鉴定和质量控制带来很大的难度。而中药指纹图谱是把中药材、中药制剂等作为研究对象，运用现代科学分析技术，找到能够表征其化学特征的色谱图或光谱图等数据；它是一种综合的、可量化的分析鉴定方法，是建立在中药复杂的化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材、中药制剂、半成品质量的真实性、优良性和稳定性；它的显著特点是“整体性”和“模糊性”[13]。因此，对具有良好重复性的指纹图谱，用于中药材与中药制剂的质量控制，将对中药走向现代化和国际化具有重要意义。

采用全波长对参花胶囊样品进行测定，依据三维色谱图及对应波长下峰的信息量，结果254 nm时信息量较大，故将其作为HPLC指纹图谱的定性波长。测定4种化合物含量检测波长的选择，根据二极管阵列对绿原酸、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、迷迭香酸扫描，结果最大吸收分别在326，403，286和329 nm，同时依据各峰的面积值与分离度(≥1.5)，检测波长选择320 nm，各峰信息较为理想。

由于中药复方中成分众多，各成分溶解性不一样，等度洗脱难以充分洗脱，所以采用梯度洗脱的方法。选用Kromasil C18(250 mm×4. 6 mm，5 μm)色谱柱，采用梯度洗脱方法，比较了不同流动相系统乙腈-磷酸水溶液、甲醇-水、乙腈-醋酸水溶液、乙腈-水。考察了磷酸水溶液不同质量浓度(2.0，5.0，8.0和10.0 g·L-1)。结果表明，乙腈-5.0 g·L-1磷酸水溶液系统优于其他流动相系统，故选乙腈-5.0 g·L-1磷酸水溶液流动相系统作为本制剂指纹图谱流动相系统。

对制样方法进行了比较，采用甲醇与水超声提取，比较了甲醇的不同体积分数(20%，40%，50%，60%，70%，80%，90%和100%)、不同提取方法(超声、加热回流、浸渍等)、不同超声时间(5，10，15，20，30，40，50和60 min)。对不同溶剂比较，结果表明，甲醇优于水；对不同提取方法比较，结果表明，超声提取出峰多、峰面积大、时间短；对不同超声时间比较，结果表明，甲醇超声30 min以后，各个峰的面积不增加。综合上述各因素，选择70%甲醇、超声30 min，所得指纹峰较理想。

对不同柱温与流速进行比较，柱温超过或低于30 ℃，但大部分色谱峰分离度小或不能分开；流速高于或低于0.8 mL·min-1，大部分色谱峰分离度差。因此，选择便于控制的柱温30 ℃与流速0.8 mL·min-1。

综上所述，通过对10批次的参花胶囊样品进行相似度计算，结果数值介于0.966～0.998。同时，4种化合物定量结果，含量均一稳定，表明建立的参花胶囊的HPLC指纹图谱方法与含量测定方法，具有良好的分析评价能力，具有简便、稳定、可靠、准确等明显优势，因此，均可用于该制剂的质量控制。

参考文献：

[1] 程茜菲，刘银环，许苗苗，等. 丹参饮片HPLC指纹图谱研究[J]. 西北药学杂志，2013， 28(6)： 556-558.

[2] 徐丽君，黄光英. 丹参的化学成分及其药理作用研究概述[J].中西医结合研究，2009，1(1)：45-46.

[3] 刘海青，吕东，陈岳蓉. 全中药材市场商品丹参中4种丹参酮成分的HPLC测定[J]. 药物分析杂志，2005，25(2)：229-230.

[4] 金玉青，洪远林，李建蕊，等. 川芎的化学成分及药理作用研究进展[J]. 中药与临床，2013，4(3) ：44-48.

[5] 徐如英，童树洪. 红花的化学成分及药理作用研究进展[J]. 中国药业，2010，19(20)：86-87.

[6] 田兰，吴桂荣，王岩. 红花黄色素研究进展[J]. 西北药学杂志，2007，22(4)：218-220.

[7] 阮金兰，赵钟祥，曾庆忠，等. 赤芍化学成分和药理作用的研究进展[J]. 中国药理学通报，2003，19(9)：965-970.

[8] 张清华，张玲. 菊花化学成分及药理作用的研究进展[J]. 食品与药品，2007，9(2)：60-63.

[9] 吴士杰，李秋津， 肖学风，等. 山楂化学成分及药理作用的研究[J]. 药物评价研究，2010，33(4)：316-319.

[10]刘育辰，陈有根，王丹. 甘草化学成分研究[J]. 药物分析杂志，2011，31(7)：1251-1252.

[11]陶晡，刘晓清，屈振刚. 甘草化学成分研究进展[J]. 河北农业科学，2009，13 (3)：77-79.

[12]中国药品食品监督管理局. 关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的通知)[J]．中国药品标准，2000，1(4)：3-4

[13]彭川丛，梁英娇. 中药指纹图谱研究进展[J]. 实用中医药杂志，2010，26(11)：810-812.