当归总黄酮提取方法比较及工艺条件优化

刘芳， 杨跃寰， 杨王霖

(四川理工学院生物工程学院， 四川自贡643000)

当归总黄酮提取方法比较及工艺条件优化

刘芳， 杨跃寰， 杨王霖

(四川理工学院生物工程学院， 四川自贡643000)

对当归总黄酮进行提取，比较其提取方法，优化其最适提取方法的工艺条件。试验分别采用水煎煮法、乙醇回流法、超声波提取法对当归总黄酮进行提取，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定总黄酮含量，采用正交试验优化提取工艺条件。试验结果表明：乙醇回流法为当归总黄酮的最适提取方法，当提取温度85 ℃、提取时间2.0 h、料液比1∶30、乙醇浓度80%时，得当归总黄酮含量为10.066 mg·g-1，比优化前提高了59.52%。试验较为完整地对当归总黄酮的提取方法和提取条件进行了研究，可为开发和利用当归总黄酮提供理论依据。

当归；总黄酮；提取

引言

当归(Angelicasinensis)的化学成分主要有多糖类、苯酞类、香豆素类、阿魏酸钠、黄酮类、挥发油类化合物及其他成分[1-2]。研究表明，从当归中分离到的黄酮类化合物具有抑制NO生成、抗氧化和抑菌杀菌等作用[3-5]。黄酮类化合物的提取方法众多，主要有溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法、酶解法、超临界流体萃取法、双水相萃取分离法、半仿生提取法等[6-10]。日前已有研究者开始探索当归总黄酮提取工艺，如王芙蓉[4]、李谷才[5]等，但均采用醇提法。本研究分别采用水煎煮法、乙醇回流法、超声波提取法对当归总黄酮进行提取，比较其提取方法，优化其最适提取方法的工艺条件，旨为进一步开发和利用当归总黄酮提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 原料与试剂

当归粉：市售；其他试剂：均为分析纯。

1.1.2 主要设备及仪器

DK-98-1水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；RE52CS/B-220旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；UP400S手提式超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；WFJ7200紫外可见风光光度计：上海无尼柯仪器有限公司；回流装置、圆底烧瓶、容量瓶、移液管、试管等：均为微生物实验室常规仪器。

1.2方法

1.2.1 当归总黄酮提取液的制备

水煎煮法：称取1 g当归粉于圆底烧瓶，加入25 mL蒸馏水于其中，浸泡20 min后，保持沸腾回流1 h，冷却后抽滤得滤液，滤渣再次加入25 mL蒸馏水浸泡20 min后沸腾回流1 h，冷却抽滤，合并滤液。将滤液旋转蒸发浓缩至仅剩5 mL，转入100 mL容量瓶中，用60%乙醇稀释定容至刻度，得提取液。

乙醇回流法：采用75%的乙醇，提取温度70 ℃，其他方法和条件同水煎煮法。

超声波提取法：超声波功率50 W，其他方法和条件同乙醇回流法[11]。

1.2.2 提取液中总黄酮含量的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测提取液中总黄酮含量，用芦丁标准品绘制标准曲线[5]，按标准曲线制备步骤操作，测定提取液的吸光度，根据吸光度在芦丁标准曲线上查找对应的芦丁浓度，计算出提取液总黄酮浓度。1 g当归中所含总黄酮量计算公式为：

式中：C—总黄酮浓度(mg·mL-1) 100—提取液的总体积(mL)m—提取所用原料质量(g)

1.2.3 当归总黄酮最适提取方法的确定

比较水煎煮法、乙醇回流法、超声波提取法提取液中总黄酮含量，确定出当归总黄酮的最适提取方法。

1.2.4 最适提取方法工艺条件的优化

通过单因素试验和正交试验，对最适提取方法的工艺条件进行优化，确定出最佳工艺参数。

1.2.5 验证试验

考察最佳工艺的稳定性和合理性，在优化组合条件下进行3次平行试验，分别测定当归中总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1测定波长的选择和标准曲线的绘制

在紫外分光光度计的波长范围内扫描，得在509 nm处吸光度最大，因此试验所用吸光度测定波长为509 nm。芦丁标准曲线如图1所示。

图1 芦丁标准曲线

2.2最适提取方法的确定

分别测定三种提取方法提取液中当归总黄酮含量，每种方法平行三次，取平均值，测定结果见表1。

表1 三种提取方法当归总黄酮含量

由表1可知，提取方法不同，提取效果也不一样，采用乙醇回流提取当归中总黄酮，其总黄酮含量最高，故确定乙醇回流法为当归总黄酮的最适提取方法，并优化其提取条件。

2.3单因素试验

乙醇回流提取过程中，对提取效果影响较大的因素主要有乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间等。以乙醇浓度75%、料液比1∶25、提取温度70 ℃、提取时间1 h为初始提取条件。

2.3.1 乙醇浓度对提取液中总黄酮含量的影响

分别测定乙醇浓度为70%、75%、80%、85%、90%、95%时当归总黄酮含量，其他因素为初始水平。测定结果如图2所示。

图2 乙醇浓度对总黄酮含量的影响

由图2可知，随着乙醇浓度的增加，当归总黄酮含量增加，乙醇浓度为85%时总黄酮含量达到峰值，但随着乙醇浓度的进一步增加，总黄酮含量反而降低，可能是由于不同浓度的乙醇所提取的黄酮种类和含量不同，也可能是高浓度的乙醇更利于当归中其他成分的提取，从而影响了吸光度的测定值。因此初步确定乙醇浓度为85%。

2.3.2 料液比对提取液中总黄酮含量的的影响

分别测定料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45时当归总黄酮含量，乙醇浓度85%，提取温度和提取时间不变。测定结果如图3所示。

图3 料液比对总黄酮含量的影响

由图3可知，随着料液比的增加，当归总黄酮含量增加，料液比为1∶30时总黄酮含量达到峰值，但随着料液比的进一步增加，总黄酮含量反而降低，这可能是料液比增加到1∶30时，当归中总黄酮与溶剂乙醇之间已达到平衡，当料液比进一步增加反而使溶质中的其他物质溶解增加，而使相应的吸光度降低。因此初步确定料液比为1∶30。

2.3.3 提取温度对提取液中总黄酮含量的影响

分别测定提取温度为65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃时当归总黄酮含量，乙醇浓度85%，料液比1∶30，提取时间不变，测定结果如图4所示。

图4 提取温度对总黄酮含量的影响

由图4可知，随着提取温度的增加，当归总黄酮含量增加，提取温度为80 ℃时总黄酮含量达到峰值，但随着提取温度的进一步升高，总黄酮含量反而降低，可能是由于温度过高导致总黄酮结构遭到破坏，也可能是高温更有利于当归中其他成分溶出，而影响了吸光度的测定结果。因此初步确定提取温度为80 ℃。

2.3.4 提取时间对提取液中总黄酮含量的影响

分别测定提取时间为0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h时当归总黄酮含量，乙醇浓度85%，料液比1∶30，提取温度80 ℃。测定结果如图5所示。

图5 提取时间对总黄酮含量的影响

由图5可知，随着提取时间的增加，当归总黄酮含量增加，提取时间为1.5 h时总黄酮含量达到峰值，但随着提取时间的进一步增加，总黄酮含量反而降低，可能是由于提取时间过长导致当归总黄酮被氧化，也可能是当归中其他成分被溶出，干扰了吸光度的测定。因此初步确定提取时间为1.5 h。

2.4正交试验

以提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度为4个因素，以单因素试验的最适值和左右值设置3个水平进行L9(34)的正交试验，通过正交试验最终确定乙醇回流提取当归总黄酮的最佳工艺条件。L9(34)因素水平见表2，试验结果见表3。

表2 正交试验因素和水平

表3 正交试验结果

由表3的极差R可知，四因素对当归总黄酮含量的影响大小是B>C>A>D，即提取时间影响最大，其次是料液比，再次是提取温度，而乙醇浓度对当归总黄酮含量的影响最小。从k值可以看出，乙醇回流提取当归总黄酮的最佳工艺条件为：A3B3C2D1，即提取温度85 ℃、提取时间2.0 h、料液比1∶30、乙醇浓度80%。

2.5验证试验

在最佳工艺条件下采用乙醇回流法提取当归总黄酮，平行操作三次，求平均值，测定结果见表4。

表4 最佳提取工艺条件下当归总黄酮的含量(mg·g-1)

由表4可知，在最佳工艺条件下对当归总黄酮进行提取，得当归总黄酮平均含量为10.066 mg·g-1，与正交试验结果一致，比优化前提高59.52%。三次验证试验说明此最佳工艺条件具有合理性和稳定性。

3 结束语

试验采用水煎煮法、乙醇回流法、超声波提取法对当归总黄酮进行提取，得乙醇回流法为当归总黄酮的最适提取方法，其最佳工艺条件为：提取温度85 ℃、提取时间2.0 h、料液比1∶30、乙醇浓度80%。在最佳工艺条件下提取当归总黄酮，得当归总黄酮含量为10.066 mg·g-1，比优化前提高59.52%，比文献[4]提高6.39%。验证试验表明此最佳工艺条件具有合理性和稳定性。试验较为完整的对当归总黄酮的提取方法和提取条件进行了研究，可为开发和利用当归总黄酮提供理论依据。

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[5] 李谷才,魏文亭,高堂杰,等.当归总黄酮提取及其体外抑菌活性研究[J].时珍国医国药,2011,22(22):310-311.

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[11] 植物材料中总黄酮分离提取.百度文库[EB/OL].(2010-12-23)http://wenku.baidu.com/view/ 3e04f980e5 3a580216fcfe1e.html.

A Comparison of the Extraction Methods of Total Flavonoids FromAngelicaSinensisand the Optimization of Processing Conditions

LIUFang,YANGYuehuan,YANGWanglin

(School of Bioengineering, Sichuan University of Science & Engineering, Zigong 643000, China)

The total flavonoids is extracted fromAngelicasinensis, the extraction methods are compared, and the processing conditions of the optimum extraction method are optimized. Tests are carried out by using boiling water extraction method, ethanol refluxing method and ultrasonic extraction method to extract total flavonoids fromAngelicasinensis, and the concentration of total flavonids is determined by sodium nitrite-aluminum nitrate and sodium hydroxide method, then the processing conditions of extraction are optimized by orthogonal test. The test results show that the ethanol refluxing method can get the highest total flavonoids content fromAngelicasinensiswhen extraction temperature is 85 ℃, extraction time is 2.0 h, ratio of solid to liquid is 1∶30, alcohol concentration is 80% and the content of total flavonoids extracted fromAngelicasinensisat this time is 10.066 mg.mL-1，which is 59.52% higher than that before optimization. The tests are studied relatively well on extraction method and extraction conditions of total flavonoids ofAngelicasinensis, which can provide a theoretical basis for the development and utilization of the total flavonoids ofAngelicasinensis.

Angelicasinensis; total flavonoids; extraction

2014-09-26

四川省教育厅自然科学重点项目(11ZA260)；四川省大学生创新创业训练计划项目(201410622024)

刘 芳(1966-)，女，四川自贡人，教授，主要从事食品微生物方面的的研究，(E-mail)sy5162524@sina.com

1673-1549(2014)06-0005-04

10.11863/j.suse.2014.06.02

R284.2

A