PPARγ与重组腺病毒载体

李琼 （综述），黄起壬 （审校）

（1.南昌大学药学院药理教研室，南昌 330006；2.江西护理职业技术学院护理系，南昌 330052）

基因免疫和治疗是将外源目的基因转移到机体内，表达具有生物学功能的蛋白，达到免疫预防或治疗的目的。病毒载体是常用的基因导入方式之一，而腺病毒载体由于转基因效率高，不受靶细胞是否为分裂细胞所限，容易制得高滴度病毒载体，且生物活性评价较简便，在基因治疗和免疫方面有了越来越多的应用。过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPARs）超家族成员之一——PPARγ可促进脂肪细胞分化，调节脂肪细胞信号传导，在脂肪代谢中起到重要作用。本文就PPARγ、腺病毒载体的结构与特点及重组腺病毒载体在PPARγ研究中的应用综述如下。

1 PPARγ的结构与特点

PPARs是一类由配体激活的核转录因子，属于Ⅱ型核受体超家族。目前已发现由3种亚型，即α、β、γ 组成，分别含有 468，441 和 497 个氨基酸残基［1］。可与9-顺-视黄酸受体（retinoid X receptor，RXR）形成异二聚体，与辅阻遏蛋白结合，抑制靶基因表达。当受到PPARγ配体和 （或）RXR配体激活后，PPAR/RXR构象发生改变并与辅激活蛋白结合，共同结合到靶基因的PPARγ反应元件（PPREs），从而调控靶基因的表达。另外，PPARγ也能在配体依赖方式下通过抑制其他转录因子如NF-κB及活化剂蛋白-1（AP-1）家族从而直接地抑制促炎症基因的表达［2-3］。 人类的 PPARγ 基因有 4 种亚型：PPARγ1，PPARγ2，PPARγ3，PPARγ4。上述 4 种亚型的基因基本相同。由于PPARγ1和PPARγ3拥有同一个转录起始点，故PPARγ1和PPARγ3 mRNA产生相同的蛋白产物-PPARγ1。相反PPARγ2在外显子A2和外显子1有一个γ2-绝对编码外显子，从而使得PPARγ2蛋白比 PPARγ1和 PPARγ3多 30个 N端氨基酸［4］。PPARγ4 和 PPARγ1、PPARγ3 一样都编码PPARγ1蛋白，对于它目前所知甚少。PPARγ1在脂肪组织、脾脏、外周血淋巴细胞、肝脏及骨骼肌中均有表达；PPARγ2在脂肪组织中高水平表达，而在骨骼肌仅有低水平表达；PPARγ3的表达仅限定在巨噬细胞和大肠。各亚型组织分布的不同，在体内发挥的作用及影响因素不同。

PPARγ配体有内源性和外源性配体，内源性配体如花生四烯酸、LTB4、15d-PGJ2、前列腺素 A1、前列腺素D2等，外源性配体如TZDs、吲哚美辛、血管紧张素Ⅱ受体阻断剂（sartans）和WY-14643、ETYA等。PPARγ通过调节相关基因的表达，在糖脂代谢、脂肪形成以及在免疫系统中发挥重要作用，并与多种疾病如糖尿病、肥胖、高血压、癌症等的发生、发展密切相关。

2 腺病毒载体的结构与特点

腺病毒最早发现于1953年，由于它们倾向于感染上皮细胞而被命名为腺病毒（Adenovirus，Ady）。腺病毒是直径为70～90 nm的无囊膜病毒，呈二十面体对称结构。腺病毒基因组为线状双链DNA，长度约为36 kb，包装于二十面体的蛋白质外壳内。基因组的末端具有40～200 bp的倒置重复序列（ITR），左端载有包装信号Es，是腺病毒基因组复制和病毒包装必不可少的顺式作用元件，5’端有共价结合的末端蛋白（TP），与腺病毒的感染有关，对腺病毒DNA的复制起始起着重要的作用，含有TP的DNA其感染性可提高100倍［5］。腺病毒的基因组可分为两个区，即编码区和非编码区。非编码区含有顺式作用元件。编码区又可分为早期转录区和晚期转录区两种，前者有 El、E2、E3 和 E4 等 4 个区［6］，编码病毒的功能蛋白，后者有L1、L2、L3、L4和L5等 5个区，编码病毒的结构蛋白。早期转录区各区所编码的蛋白均有所差异，El区是腺病毒感染后转录和表达的第一个基因，具有转录激活其他病毒基因表达的作用；E2区则编码与DNA复制有关的蛋白质；E3区编码与病毒逃避宿主免疫监视机制有关的蛋白质，可减少感染细胞被机体免疫识别的概率；E4区基因产物与病毒DNA的复制、晚期基因表达等功能有关。在4个编码早期蛋白的转录区中，El、E3和E4区可供插入外源基因。

腺病毒作为基因表达载体的研究起源于20世纪60年代初，当时病毒学家观察到腺病毒基因组可与猿猴病毒40（SV40）基因组杂交，实质上是腺病毒基因组可承载异源性基因。自此，腺病毒成为病毒学和分子生物学的重要研究对象，其作为基因载体，在重组疫苗和基因治疗等方面开发和应用较早。与其他动物病毒载体比较，腺病毒载体具有以下优点：1）宿主范围广，对人致病性低，腺病毒广泛存在于人、哺乳动物和禽类的呼吸道、眼、消化道内，多数毒株为隐性感染，基本不致病或只引起轻微的症状［7］。2）腺病毒基因组的结构和功能研究得比较深入，Ad2、Ad5 型的全序列已了解得很清楚［8］。并且腺病毒载体并不整合进宿主细胞基因组，而是以附加体形式游离在宿主细胞基因组外。3）能同时表达多个外源基因，它是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。4）稳定。腺病毒颗粒十分牢固，不易突变。5）可容纳较大外源基因插入。6）免疫途径简便。腺病毒可以在消化道和呼吸道增殖，给苗途径简便（口服或气雾吸入）［9-10］。正是由于具有以上众多优点，如今腺病毒作为载体的研究受到更为普遍的重视。

3 重组腺病毒载体在PPARγ研究中的应用

PPARγ的生物学作用非常广泛。PPARγ是PPAR家族中最具脂肪细胞专一性的成员，它是脂肪细胞基因表达和胰岛素细胞间信号转导的主要调节者，参与脂肪细胞分化和糖脂代谢的调节［11］。其在脂肪细胞的分化过程中不仅能促进前脂肪细胞的分化，而且也能促进非脂肪细胞转分化成脂肪细胞，与肥胖的发生、发展密切相关［12］。 因此，PPAR-γ在脂质代谢中作用机制一直是肥胖和糖尿病研究领域十分关注的问题［13］。明确其靶基因谱有助于理解PPAR-γ对脂质代谢影响的分子机理；对肥胖和糖尿病等复杂疾病的诊断、预防和治疗具有积极意义。有研究［13］发现使用相对非特异性的配体激活PPARγ，能引起脂肪的生成；当使用特异性的配体TZD时，能更强的生成脂肪。说明PPARγ在脂肪细胞分化中发挥着关键性的作用。

此外，PPARγ在辅助激活因子及抑制因子的共同作用下参与癌细胞的分化、形成。许多肿瘤细胞中都发现PPARγ表达很高，例如胃癌、乳腺癌、结肠癌等，配体激活PPARγ后能抑制上述癌细胞的增殖，促进分化，并诱导其凋亡和抑制癌细胞血管的生成。激活后的PPARγ可通过上调PTEN和p21基因的表达，从而抑制癌细胞的增殖，使细胞周期停留在G1期［14-15］。当PPARγ表达量增加可使甲状腺肿瘤的生长受到抑制，但在非肿瘤细胞中不能诱导PPARγ的表达［16］。PPARγ过量表达能明显增加细胞凋亡，这些都说明了PPARγ在癌症的生成中起重要作用。

PPARγ还有许多重要的生物学作用，若能全面的了解PPARγ的功能，将对许多疾病的治疗具有重大意义。腺病毒载体可以使哺乳动物外源基因高水平表达,虽然短暂,但也可表达出占细胞总蛋白30%的重组蛋白。表达后的蛋白质要经过一系列复杂的翻译、修饰后才能确保正确的折叠及功能。这样,重组病毒表达的蛋白及哺乳动物的蛋白就与天然蛋白相同,从而避免了这些蛋白在原核生物、真核生物、昆虫细胞中表达的弊端。成功构建PPARγ的重组腺病毒载体，为进一步研究PPARγ在胰岛细胞、脂肪组织、骨骼肌细胞和内皮细胞中的生物学功能奠定良好基础。

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