哮喘气道重塑中smads蛋白变化及其对免疫的影响机制

娄春艳 综述，李 敏 审校

(1.泸州医学院，四川 泸州 646000;2.四川省医学科学院·四川省人民医院儿科，四川 成都 610072)

支气管哮喘(哮喘)是呼吸道最常见的慢性疾病，其发病率及死亡率呈逐年上升趋势［1］。哮喘患者的气道重塑是长期炎症刺激所导致组织损伤后不完全或过度修复所致，最终导致气流不可逆性阻塞和气道高反应，是哮喘反复发作的病理基础，同时也是哮喘不能完全根治的最主要原因。免疫异常是哮喘发病的核心机制，T细胞的免疫失衡在哮喘发病中发挥着至关重要的作用。近年来随着研究的深入，单纯的Th1/Th2平衡理论已不能完全解释哮喘的发病机制，由初始CD4+T细胞分化的Thl7细胞和CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cells，Treg)之间的平衡，已成为哮喘发病机制研究的新热点。TGF-β/smads信号通路是哮喘气道重塑的主要调控途径之一，它直接影响气道壁胶原蛋白的沉积，促进纤维化的形成［2］。阐明smads蛋白家族对哮喘气道重塑的影响将为我们进一步研究提供理论基础。本文对smads蛋白家族对哮喘气道重塑的影响、Th17/CD4+CD25+调节性T细胞与气道重塑的关系、smads蛋白家族与哮喘气道重塑中Th17/CD4+CD25+调节性T细胞变化的相互作用作一综述。

1 smads蛋白家族的来源、生物学特性

smads蛋白家族是在脊柱动物、昆虫和线虫体内发现的转录因子家族，是迄今为止唯一一个被证实的TGF-β受体作用的底物。Raftery等［31］首先在果蝇体内发现可以补救dpp缺失突变的分子，命名Mad(mothers against dpp)，它是Dpp受体信号传递必需的下游效应分子。随后savage等［4］通过对线虫进行基因分析克隆出Mad相关基因sma-2、sma-3、sma-4，它们共同存在一个保守的结构域，是Mad同源物，可以形成复合物协同发挥作用，所以将Mad和sma蛋白及其类似物统一命名为 smad。根据smads蛋白家族结构和功能特点将其分为3类:①受体调节型Smads蛋白(receptor-regulated smads，R-smads)包括 smad1、smad2、smad3、smad5 和 smad8，研究［5］表明smads蛋白家族是细胞内重要的信号转导蛋白，直接参与 TGF-β、骨形态发生蛋白(bone morphogeneticprotein，BMP)、活化素等的信号转导，其中smad2和 smad3能被活化素、TGF-βI受体激活;而smad1、5和8能被BMP-I型受体磷酸化而激活;②通用调节 smads蛋白(common-mediator smads，smad4)smad4可以与被磷酸化后的R-smads形成异源性多聚体，这些复合物转入细胞核内与DNA转录因子、不同的smad结合原件、转录共激活剂或者共抑制剂结合，正性或负性调控靶基因的表达［6］对于R-smads发挥功能是必不可少的;③抑制型smads蛋白(Anti-smads)，包括 smad6与 smad7，大多数静息状态的细胞中，Anti-smads主要存在于细胞核内，当外界因素作用时，其将从细胞核进入细胞内发挥作用比如TGF-β刺激、活化素和BMP信号等［7］，其中smad7作用较为广泛，对R-smads均有抑制作用，而smad6对抑制BMP的信号更有特异性，故仅对smad1、5和8具有抑制作用。另外研究表明［8］smad7也可以在细胞核内直接发挥作用，从而抑制特定基因转录。

2 smads蛋白家族对哮喘气道重塑的影响

哮喘的发病机制较为复杂，目前大多认为与免疫机制有关，涉及到多种细胞、炎症介质及细胞因子，而气道炎症及气道重塑是哮喘发生及反复发作的病理基础。近年来人们把哮喘防治研究的重点放在延缓气道重塑上，目前发现TGF-β/smad信号通路是导致哮喘气道重塑发生的重要信号转导机制之一。Smads蛋白家族是细胞内重要的TGF-β信号转导和调节分子，是唯一比较明确的TGF-β信号转导的下游信号蛋白，smads蛋白可逆的磷酸化作用在适当的TGF－β信号转导中起关键作用［9］smads蛋白家族中 smad2、smad3、smad4、smad7 均参与 TGF-β信号转导，在哮喘气道重塑中发挥着重要作用。

2.1 R-smad与哮喘气道重塑的发生 R-smad与哮喘气道重塑的发生存在相关性，smad2、smad3可以促进纤维母细胞向纤维细胞分化，促进气道肌成纤维细胞增殖。Lisa等［10］通过过表达 TGF-β、smad2可以增加气道胶原蛋白沉积，平滑肌增生，明显导致气道平滑肌增厚，由此推测smad2与哮喘气道重塑有关。Rosendahl应用鸡卵清蛋白(ova)制备小鼠哮喘模型，应用免疫组化及RT-PCR方法检测smad蛋白发现健康小鼠肺组织中几乎无smad3蛋白的表达，而哮喘小鼠中smad3蛋白表达水平显著上调。Park等［11］研究通过抑制 smad2、smad3的磷酸化，下调 TGF-β-Ⅰ型和Ⅱ型受体的表达，降低TGF-β诱导的报告基因的活性，可以抑制α-SMA、纤连蛋白、胶原纤维在人的纤维母细胞中表达，表明抑制Smad2、3的活性能抑制纤维母细胞分化，由此推测哮喘小鼠中smad3、smad2蛋白高表达与哮喘气道肌成纤维细胞增殖相关。Dijke等［12］研究发现磷酸化后的smad2、smad3可以使内皮细胞表型向间质细胞表型转化。Gregory等［13］研究发现smad3基因缺陷的小鼠经过敏原的长期刺激可见支气管周围肌成纤维细胞的数目减少、纤维化程度降低。国内孙祝美等［14］的研究通过RT-PCR及Westen Blotting测定慢性哮喘大鼠模型肺组织中 smad2mRNA、smad7mRNA表达和smads蛋白表达发现肺组织中smad2mRNA、smad2蛋白高表达，而 smad7mRNA、smad7蛋白低表达，由此推测在慢性哮喘发生中，R-smads蛋白有作用。但具体如何发挥作用的仍需进一步研究。

2.2 CO-Smads与哮喘气道重塑 CO-Smads即smad4是整个TGF-β/smad信号转导通路，一旦其表达异常将会影响TGF-β/smad的生物学功能，Smad4主要与磷酸化的R-smads蛋白形成异源性多聚体发挥作用。研究表明在哮喘大鼠气道重塑模型中发现TGF-β1、smad3与smad4蛋白高表达与气道重塑程度成正相关［15，16］。

2.3 Anti-Smad与哮喘气道重塑 Anti-Smad包含smad6与smad7，其主要通过抑制活化的R-smad而发挥作用，smad7可以对TGF-β、活化素、BMP信号传导均有抑制性，但smad6仅对BMP信号具有特异性，所以哮喘气道重塑中主要是smad7通过阻断TGF-β/smad信号转导发挥作用。smad7可以与活化的TGF-β的Ⅰ型受体结合后阻止smad2与其结合和发生磷酸化，smad7主要表达与支气管上皮细胞，Sagara等［17］发现哮喘患者支气管上皮细胞中smad7蛋白表达较正常组低表达，且与哮喘气道重塑程度呈负相关，体外实验发现取消内源性smad7可以增强TGF-β的表达，而过表达smad7抑制TGF-β的表达，由此推测是否通过人为增加smad7蛋白表达就可以延缓或者减少气道重塑的发生。

3 Th17/CD4+CD25+调节性T细胞与哮喘气道重塑的关系

目前人们认为机体内Th17/CD4+CD25+调节性T细胞存在动态平衡，二者既存在密切相关联系，在生物学功能及分化过程中又相互拮抗，TGF-β是调节分化的关键因子，单独存在时使活化的CD4+T细胞向CD4+CD25+调节性T细胞分化，当与IL-6或者IL-23同时存在时趋向于向Th17分化，CD4+CD25+调节性T细胞还能通过自身分泌的TGF-β促进Th17细胞的发育。体外试验研究表明［18］气道局部的IL-17可以促进气管结构细胞(支气管纤维母细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞及成纤维细胞)的活化，使这些细胞高度表达IL-6、IL-8和GCSF等细胞因子，进而促使中性粒细胞活化和趋化，加重气道炎症;此外，活化的中性粒细胞所产生的中性粒细胞弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，能降解弹性蛋白并促进气道腺细胞分泌，是影响气道和肺组织结构的关键因素。Sagara等［17］、Bullens等［19］的研究均证实，中重度持续的哮喘患者中均可发现高水平IL-17AmRNA表达，中性粒细胞蛋白酶能够增大支气管内成纤维细胞介导的胶原纤维的收缩反应，由此推测IL-17间接参与了气道重塑的发生。Kearley等［20］研究证实CD4+CD25+调节性T细胞细胞活性与哮喘发展相关，它可以通过IL-10减轻急性过敏性炎症、气道高反应及气道重塑的发生。庞英等［21］应用OVA制备小鼠哮喘模型发现，哮喘小鼠脾单个核细胞中CD4+CD25+调节性T细胞百分率较正常小组显著降低。黄花荣等［22］研究证实CD4+CD25+调节性T细胞与哮喘的严重程度具有相关性，哮喘患儿病情越严重，患儿外周血 CD4+CD25+调节性T细胞表达水平越低。由此推测哮喘患者体内Th17细胞数量及CD4+CD25+调节性T细胞数量表达异常与气道炎症和气道重塑的发生相关，Th17/CD4+CD25+调节性T细胞平衡失调影响了哮喘患者疾病的严重程度。

4 气道重塑中Smads蛋白家族对Th17/CD4+CD25+调节性T细胞的影响

在既往的研究中证实，smads蛋白家族、Th17/CD4+CD25+调节性T细胞之间的平衡紊乱在哮喘气道重塑的发生发展中具有重要作用，而TGF-β/smad信号通路是导致哮喘气道重塑发生的重要信号转导机制之一。但目前研究对TGF-β/smads信号通路如何影响CD4+CD25+调节性T细胞和Th17细胞分化增殖的途径尚不清楚。牟达等［23］表明在TGF-β诱导的CD4+CD25+调节性T细胞生成中FOXP3的表达与smad4的表达呈负相关。Tone等［24］最初认为FOXP3的第一增强子存在于smad3的作用位点，在iTreg分化的初期smad3就开始在此结合并促进foxp3的表达，当Smad3结合位点突变或者人们早期应用smad3的抑制剂就会导致CD4+CD25+调节性T细胞体外分化的完全消失，但随后Takimoto等［25］的研究提示 smad2和 smad3在 CD4+CD25+调节性T细胞的分化中具有互补作用，当smad3缺失时，smad2可以承担相应的作用而维持CD4+CD25+调节性T细胞的分化，只有smad2和smad3都缺失时，CD4+CD25+调节性T细胞的分化才会被完全抑制，由此推测smad2和smad3调控CD4+CD25+调节性T细胞的分化。Martinez等［26］研究表明 smad2在RORYt的协同作用下可以促进Th17细胞的生成，敲除smad2蛋白基因的小鼠体内Thl7细胞的反应降低，Smad2缺陷的小鼠体内T细胞分化成Thl7细胞的能力减少，由此推测smad2与Th17细胞的生成呈正相关。Fantini等［27］研究表明FOXP3可以通过下调smad7来增强TGF-β信号转导通路，从而介导tregs的细胞发挥免疫抑制作用。当T细胞中缺乏smad7时可以延缓TH1细胞的应答反应及外周T细胞的增殖，但是对Th17细胞的应答反应却无影响。由此推断在哮喘气道重塑中smads蛋白家族同样影响了Th17及CD4+CD25+调节性T细胞细胞的分化和平衡调节，是我们今后进一步研究哮喘发病机制和降低疾病严重性的新的方向之一。

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