口腔鳞状细胞癌侵袭和转移过程中上皮－间充质细胞转换作用的研究进展

谭 红，邓婷婷，聂敏海

(泸州医学院附属口腔医院口腔内科，泸州医学院口颌面修复重建和再生实验室，四川 泸州 646000)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤，每年有超过27万人发病，是威胁人类健康的主要疾病之一，原位侵袭和远处转移是影响其预后的重要因素。阻止癌前病变突破基底膜转化为浸润癌，是OSCC早期防治的关键。近年来，有关上皮-间充质细胞转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤发生、发展中的信息不断涌现，认为EMT在肿瘤细胞浸润和转移过程中扮演了重要角色，促使研究者们研究并分析EMT在OSCC发生、发展中的作用及其机制。本文对EMT的分子机制、与肿瘤转移的关系及其调控OSCC侵袭转移的研究进展作一综述。

1 一般分子机制

1.1 EMT的概念 EMT是指具有极性的上皮细胞向具有运动能力的间充质细胞转换并获得迁移和侵袭能力的过程，涉及多种调控分子和复杂的信号网络系统，与动物的多个生理和病理过程相关。细胞经历EMT后发生一系列生物学改变，包括细胞极性消失、细胞间连接丧失、细胞游走或散在分布、上皮标志物缺失而间充质标志物重新表达等［1］。间充质细胞也可以逆向转化为上皮细胞即间充质-上皮细胞转换(mesenchymal-epithelialtransition，MET)。EMT和MET表现为动态转化过程，胚胎发育过程中EMT产生的间充质细胞可以重新转化为上皮细胞。研究发现肿瘤转移过程中发生的MET可能与胚胎发育过程中的MET过程类似。

1.2 EMT的分型 依据EMT的发生背景、生物学行为和标志物不同将其分为3型。Ⅰ型:胚胎发育和组织分化过程中的EMT;Ⅱ型:伤口愈合、组织再生、器官纤维化中的EMT;Ⅲ型:肿瘤细胞转移和侵袭过程中的EMT。对于Ⅲ型EMT，癌细胞经历EMT后并不完全转化成间充质细胞，而是具有部分EMT特性，包括上皮细胞标志物表达降低、间充质细胞标志物表达增高、基质金属蛋白酶表达亢进等，细胞表现为低分化形态，具有浸润性强、恶性程度高的生物学特性［2］。大量研究证实EMT参与癌细胞侵袭和转移过程，癌标本中EMT的多个标志物与肿瘤转移、复发率增高以及成活率下降相关。然而，只有肿瘤进展前沿的某些癌细胞经历EMT，其他癌细胞仍然保留其上皮性状。

1.3 EMT相关分子 参与EMT的分子包括区分上皮细胞与间充质细胞的特定标记物和可使细胞转向间充质细胞或上皮细胞状态的调控者。细胞经历EMT通常表现出波形蛋白、N-钙粘蛋白、纤连蛋白及整合素 αvβ6表达增加;E-钙粘蛋白、桥粒斑蛋白、细胞角蛋白和occludin表达减少［3］。下面介绍最近研究报道的调控代表分子:E-钙粘素、转化生长因子-β(TGF-β)、转录抑制因子及 miRs。

1.3.1 E-钙粘素 E-钙粘素是一种钙依赖性跨膜糖蛋白，表达于大多数上皮组织，构建相邻细胞间的黏附连接，被认为是EMT的一个“主调节器”。EMT的一个特征性表现是细胞与细胞间粘附缺失并伴有E-钙粘素表达减弱或缺失，其缺失可导致人类多种恶性肿瘤发展、转移。EMT引发的细胞间粘附缺失和随后的由整合素(如 β4，α5β1，αVβ6)介导的细胞-细胞外基质粘连是癌症进展、侵袭和转移的第一个关键步骤［4］。肿瘤细胞E-钙粘素表达缺失和患者预后不良相关。在上皮性肿瘤进展过程中许多因素导致了E-钙粘素表达/功能丧失，这些因素包括:E-钙粘素的DNA甲基化、E-钙粘素基因突变、染色体畸变、生长因子诱导激活转录抑制物抑制E-钙粘素转录、E-钙粘素被蛋白酶降解［5］。

1.3.2 TGF-β信号 多种生长因子诱导E-钙粘素表达/功能缺失，促进肿瘤细胞迁移和侵袭，包括TGF-β、IL-6、HGF 及其受体 Met、EGF、IGF、FGF 等。研究发现TGF-β诱导EMT，使E-钙粘素的DNA甲基化增加，阻止E-钙粘素基因转录;撤消TGF-β，E-钙粘素重新表达促进EMT过程逆转［6］。TGF-β与EMT相关的其它信号传导机制包括激活SMA和Smad蛋白质，促进细胞运动和TGF-β自分泌，进一步增强EMT过程，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和PI3K/Akt途径依赖于Smad的激活。TGF-β还激活整合素、Notch和 Wnt信号通路，触发 EMT发生［7］。TGF-β受体表达不足的小鼠皮肤和结肠癌模型预后较好。

1.3.3 转录因子 几个转录抑制因子家族调控EMT，包括锌指蛋白Snail1和Snail2、两手锌指δEF1家族因子(δEF1/Zeb1和SIP1/Zeb2)以及螺旋-环-螺旋因子Twist和E12/E47［8］。信号通路如TGF-β、Wnt信号级联和PI3K/AKT轴与这些转录抑制因子有关。这些抑制因子与E-钙粘素基因启动子结合后导致多种E-钙粘素表达的表观遗传沉默。例如，Snail可通过三条途径抑制E-钙粘素表达:①诱导激活组蛋白脱乙酰基酶，以除去组蛋白的乙酰基，导致组蛋白和DNA高亲和力结合，从而阻止E-钙粘素基因转录;②组蛋白去乙酰化还可增强多梳抑制复合物2和DNA之间的结合，引起DNA甲基化，从而抑制 E-钙粘素基因的转录［9］;③此外，Snail可上调ZEB1表达，进一步抑制E-钙粘素表达。与Snail对E-钙粘素表达的抑制作用一致，E-钙粘素表达与Snail之间的负相关性已在OSCC患者中得到证实［10］。

1.3.4 miRNAs 最近研究发现，特殊的微型核糖核酸(miRs或 miRNAs)调控着 EMT，如 ZEB1和ZEB2通过miR-200(miRNA-200)家族的调节，miR-200缺失可导致EMT。其它调节ZEB1/2的miRNA包括 miR-205 和 miR-192/215［11］。调节 Snail1 或Snail2 的 miRNA 包括 miR-1、miR-29b、miR-30c、miR-34和miR-203［12］。其它与 EMT相关参与蛋白质翻译的基因包括:Y型盒结合蛋白1(YB-1)和异质核核糖核蛋白E1(hnRNP E1)。此外，EMT通过下调上皮剪接调控蛋白1和2(ESRP1和ESRP2)在基因转录的选择性剪接中启动广泛变化［13］。

2 EMT 与肿瘤转移

远处转移是癌症发展的最后阶段，并为癌症相关死亡的主要原因。该过程由多个步骤组成，肿瘤细胞从原发部位逸出后侵入肿瘤基质，并通过内渗直接进入血液循环或淋巴系统;失巢凋亡的环境使大多数循环中的肿瘤细胞凋亡，如果肿瘤细胞生存，它们可以粘贴到内皮细胞并从循环外渗到周围组织中到达更合适的位点;最后，肿瘤细胞远处定植生长在新的环境［8］。癌细胞经历EMT后能够获得侵入性并进入周围间质，创造有利于肿瘤侵袭和转移的微环境。EMT与肿瘤发展、侵袭、转移、复发和耐药密切相关。体外实验、动物模型和临床病例分析的数据均支持EMT在肿瘤转移中发挥重要作用。癌症发展和转移中的EMT过程与在胚胎发育过程中观察到的非常类似。在转移性肿瘤形成的早期阶段，癌细胞在转移部位必须经过反向转化即MET，使转移肿瘤的主要病理特征与原发肿瘤一致。研究发现，去除EMT的诱导剂如TGF-β，建立缺氧环境在体外可观察到MET。相似的过程也发生在转移部位，需要癌症细胞重新表达E-钙粘素用于细胞黏附［14］。

2.1 EMT与肿瘤干细胞 越来越多的证据支持假说:大多数肿瘤含有细胞亚群，通常称其为肿瘤起始细胞或“肿瘤干细胞”，它们具有自我更新和重新生成肿瘤中所有类型细胞的能力［15］。这些肿瘤干细胞也表达EMT标志物，可以通过其特定的细胞表面和其他标记物从肿瘤细胞中分离。此外，诱导永生化的人乳腺上皮细胞经历EMT，发现细胞也获得与干细胞相关的特征，如表达干细胞标记物，形成微球体的能力增加［16］。研究发现EMT表型的细胞是肿瘤干细胞的丰富来源，EMT和肿瘤干细胞之间存在着生物学联系［17］。部分研究者认为癌症EMT和肿瘤干细胞理论可能是一致的，肿瘤干细胞部分通过与EMT相关的过程获得转移能力。

2.2 EMT与肿瘤微环境 肿瘤微环境由细胞外基质(ECM)、癌相关成纤维细胞、肌成纤维细胞、免疫细胞及癌症进展和转移需要的可溶性因子组成。肿瘤微环境中癌细胞间的相互作用可以通过介质如生长因子、细胞因子和ECM蛋白的自动和/或旁分泌诱导EMT［18］。在乳腺癌细胞中，癌相关成纤维细胞的培养物可以诱导EMT。在原发性大肠癌的侵袭前沿去分化的间叶细胞样肿瘤细胞中发现核β-连环蛋白表达。癌相关成纤维细胞可以诱导癌细胞经历EMT。这些研究表明，肿瘤微环境可诱发或维持EMT［19］。同样，OSCC 细胞可以通过 TGF-β 分泌直接诱导为肌成纤维细胞表型。TGF-β信号通过间质肌成纤维细胞可诱导肝细胞生长因子(HGF)分泌，促进肿瘤细胞增殖和侵袭。

3 EMT与OSCC侵袭和转移

3.1 OSCC中的EMT OSCC因其侵袭性和高死亡率成为人类极具杀伤力的癌症之一。细胞经历EMT后表现出多种上皮标志物下调和间质标记物上调。最近的研究发现在OSCC细胞株中上皮细胞表型表现出E-钙粘素和MMP-9下调，而间质细胞表型表现出波形蛋白和MMP-2上调，波形蛋白表达于OSCC侵袭前沿癌细胞的细胞质中。钙粘蛋白转换，即E-钙粘素表达缺失而N-cadherin表达增加，是人类癌症EMT的关键。Snail是EMT过程中调节E-钙粘素蛋白的一个主要基因。在OSCC模型中，Snail转染的细胞表现出完全的EMT表型，呈现成纤维细胞样外观，表达波形蛋白，E-钙粘素转换为N-钙粘素以及半桥粒缺乏。此外，在这些细胞中ZEB-1和ZEB-2表达上调。在头颈部鳞状细胞癌模型中，大多数病例N-cadherin高表达，且N-cadherin表达与恶性行为显著相关［20］。

3.2 OSCC中EMT相关的信号通路

3.2.1 PI3K/Akt信号通路 PI3K/Akt信号通路的激活常见于包括OSCC在内的人类癌症，尤其是Akt-1和Akt-2过度表达于OSCC。PI3K/Akt信号转导通路的激活是OSCC中EMT的一个重要特征。为探讨Akt蛋白在OSCC中的生物学作用，研究者培养OSCC细胞株设计激活Akt。结果发现OSCC细胞发生EMT，并伴有E-钙粘素、桥粒斑蛋白、β-连环素下调和波形蛋白上调。形态上，口腔鳞癌细胞失去上皮特性而获得成纤维细胞样特性。此外，在动物实验中经历EMT的细胞表现为细胞-细胞间附着降低，运动性和侵袭性增加。当Akt活性受到抑制，OSCC可发生MET及E-钙粘素重新表达，从而恢复上皮特点［21］。这种现象是癌细胞在转移部位定植及适应新的微环境的重要一步。Hong等［22］认为，对于OSCC患者，Akt抑制剂是一种控制癌细胞的侵袭和转移很有前途的治疗药物。

3.2.2 TGFβ信号通路 在正常上皮细胞和细胞癌变的早期阶段，TGF-β是一种抑癌基因，随着癌变进展，癌细胞可利用TGFβ作为一种有效的的致癌活化剂。TGFβ在发育和包括OSCC在内的人类癌症中诱导 EMT。Qiao等［23］发现用重组 TGFβ1刺激OSCC细胞后，Slug和MMP-9表达上调，而Snail的表达上升和下降与OSCC细胞MMP-2表达一致。认为Slug和 Snail是 TGFβ1触发 EMT的调控者。Richter等［24］研究发现在OSCC中EMT由多种生长因子介导，包括EGF和TGFβ1。用EGF或TGF-β1处理OSCC细胞可刺激诱导表型转化，其波形蛋白上调和E-cadherin下调，OSCC细胞显示侵袭力增强并粘附到I-IV胶原蛋白。TGF-β和EGF在EMT中扮演着重要的角色，调节ECM降解和促进OSCC发展。

3.2.3 Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin 信号通路是细胞增殖、肿瘤发生和EMT中的一个主要信号通路。β-连环蛋白在细胞质的异常积累可诱导TCF/LEF-介导的转录激活，上调MMP-7，从而诱导OSCC细胞发生 EMT，促进侵袭和转移［25］。Iamaroon等［26］发现在 OSCC中存在TGFβ信号通路异常，伴有Smad4蛋白表达减少或缺失。这些研究结果表明一些OSCC可能采用另一种信号途径，如PI3K/Akt，MEK/ERK 或 Wnt 基因/β-连环蛋白途径。

研究发现缺氧在EMT中发挥着关键作用。缺氧的微环境对于任何肿瘤细胞都是很常见的，并能通过调节转录抑制剂的表达与活性水平触发EMT。在舌鳞癌组织中，缺氧诱导因子(HIF)-1α，HIF-2α，Twist-2过度表达，且这些分子(HIF-2α的除外)的过量表达与更短的生存期相关［27］。HIF-1α、HIF-2α、Twist-2中的两个以上的标记物联合表达对于舌鳞癌患者具有重要的预后预测作用。

4 展望

OSCC是一种破坏性疾病，目前仍是全球公共健康的一个主要威胁。研究EMT在肿瘤和OSCC中的作用及其机制，对阐明OSCC的生物学行为、寻找有效的治疗方法和判定预后具有重要意义。

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