乳粉中维生素K1测定的检验方法研究

文/ 徐亚麦 赵泽民

（黑龙江龙丹乳业科技股份有限公司）

维生素是一类低分子化合物，它不是构成组织的成分，也不供应热能，但它与人体的健康有着密切的关系。如人体缺乏维生素，不仅不能正常生长发育，生理作用不能协调一致，而且还会引起各种疾病，甚至死亡。

维生素K类物质，简单地说就是一系列具有维生素K活性的甲萘醌的系列衍生物的总称。维生素K最早由丹麦化学家达姆发现，达姆在研究胆固醇代谢原理时意外发现与血液凝固有关的物质并证实其为脂溶性维生素，于是将这种抗出血作用的物质命名为维生素K。1939年，人们从绿色植物中提取出了维生素K1，并将其用于治疗凝血酶原过低症及其各种出血症，收到了很好的效果。

乳品企业一般采用GB 5413.10－2010测定产品中的维生素K1含量。该方法采用高压液相色谱法，具有精密度高，分离效果好，分析速度快等优点，为乳制品的质量控制和安全监测提供了重要的技术支持。但由于K1性质不稳定，受光、氧化剂、强酸或强碱等作用而分解，同时该方法操作步骤繁琐、环节多，因此很多实验室在K1的测定过程中出现了不出峰、检测数值低、重现性不好等问题。本文特针对这些问题进行了试验，最终找到了解决措施，得到了理想的检测数据。

1 测定原理

用脂肪酶降解试样中的不饱和脂肪酸，对于含淀粉的试样需要先用淀粉酶降解，经碱皂化后，用正己烷提取维生素K1。通过液相色谱法分离，柱后还原维生素K1，荧光检测器检测，外标法定量。

2 试验方法

2.1 仪器

高压液相色谱仪（岛津L C-20A，带有荧光检测器）；旋转蒸发仪（上海沪西）；控温空气浴振荡器（哈尔滨东联）；氮吹仪（天津奥特赛恩斯）；色谱柱（岛津，C18，150 mm×4.6 mm，5µm）；锌还原柱（上海安谱，4.6 mm×50 mm）。

2.2 试剂

脂肪酶（酶活力≥700 U/mg，sigma公司）；维生素K1标准品；甲醇（色谱纯）；二氯甲烷（色谱纯）；正己烷（色谱纯）；冰醋酸（纯度99.9%，分析纯）；氯化锌（分析纯）；无水乙酸钠（分析纯）等。

2.3 样品处理

试验过程中要特别注意：由于维生素K1遇光易分解，整个操作应避光。

2.3.1 称样约2.5 g于三角瓶中，用30 mL约50 ℃的水溶解。加入1 g脂肪酶，于（37±5）℃控温空气浴振荡器中过夜，使其充分酶解。取出酶解好的试样，加入2 mL氢氧化钠溶液，用50 mL乙醇将溶液转入250 mL的分液漏斗中，充分混匀。之后用50 mL正己烷再次润洗三角瓶，转入分液漏斗中。

2.3.2 先手动振摇，放气，待无气体排出后放置在摇床上充分振摇2 min，取出静置分层（若不分层，可加少量饱和氯化钠溶液）。放出下层水相于另一个250 mL的分液漏斗中，留下有机相。

2.3.3 向水相中再次加入50 mL正己烷再次萃取。合并有机相。用适量蒸馏水洗有机相2 次。将有机相通过无水硫酸钠脱水过滤到一个500 mL的烧瓶中，在旋转蒸发器上于（40±2）℃下蒸发至近干。用正己烷转移残留物到一个10 mL的试管中，置氮吹仪上于（40±2）℃下吹干，准确加入1 mL正己烷，充分振荡溶解残留物。将试管放入冰箱中在0 ℃以下冷冻1 h，使沉淀物充分沉淀到试管底部。将上清液经微孔滤膜过滤，待测。

3 结果与讨论

3.1 色谱分离条件的选择

国标方法中对于柱温没有特别说明，不设定柱温会导致保留时间漂移，因此本实验室将柱温设定为30 ℃。

配制流动相的量筒、烧杯、玻璃棒、溶剂过滤器一定要刷洗干净，烘干后使用。

3.2 方法线性试验

按色谱条件对维生素K1系列标准溶液进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，测得回归方程为：y=1.77×10-7X-0.19，相关系数为0.9993。结果表明，维生素K1在0～4.00 µg/mL线性关系良好。

3.3 试验过程中要控制好的关键点

3.3.1 脂肪酶（酶解脂肪）：要保证脂肪酶的活力；脂肪酶的加入量不可低于0.6 g，否则酶解不充分，加入正己烷萃取时萃取不充分，最终导致数值偏低或检测不出来；脂肪酶可以直接加入到样品中，也可以将其溶解后再加入到试样溶液中，以确保酶更好地溶解；酶解时间不得少于3 h。

3.3.2 萃取时，实验室的温度最好控制在25 ℃以上，因为温度过低会影响维生素K1的萃取。萃取过程中使用的蒸馏水应适当加温，温度应控制在30 ℃左右，保证萃取充分。

3.3.3 氢氧化钠的作用是使酶解后的脂肪生成脂肪酸钠溶解于水相中，氢氧化钠要现用现配，加入的量也不应该过多或过少，加入得过少会不容易分层，加入得过多会和维生素K1反应，都会使最后的结果偏低；氢氧化钠加入后，要给予一定的反应时间，约0.5 min后再加入乙醇，乙醇的作用是可以保护维生素K1不参与反应，促进分解，还可以起到消泡作用促进分层。

3.3.4 萃取过程振荡要充分，注意放气，防止爆炸；收集有机相的过程要注意避免损失；萃取后要将下层的水相放干净，否则加水后会有絮状沉淀，影响分离效果。

3.3.5 加入饱和氯化钠的目的是为了防止乳化，更好地分层提取。

3.3.6 有机相经无水硫酸钠脱水时，要注意分液漏斗内的有机相过滤完后要用正己烷冲洗分液漏斗内壁和下方的管口，防止试样流失。

3.3.7 旋转蒸发时不可蒸干，近干即可。用正己烷少量多次（多于3 次）冲洗到10 mL带塞的试管中（试管使用之前要用正己烷试漏，避免样品损失）。

3.3.8 氮吹时一定要吹干，不吹干定容时会使试样体积不同，影响结果。

3.3.9 氮吹后加入正己烷充分溶解后，要将试管放入0 ℃以下冰箱中冷冻至少1 h，冷冻的作用是使溶解到有机相中的少量不饱和脂肪酸凝固下沉。

4 结语

综上所述，在维生素K1的测定过程中，要充分了解实验机理，掌握操作中的关键点，养成良好的日常操作习惯；要做到事事仔细认真，不断总结得失，善于分析数据，方能获得理想的检测结果。

[1]顾瑞霞.乳与乳制品的生理功能特性.北京：中国轻工业出版社，2000.

[2]丁静煦.维生素K的应用和生产介绍.中国维生素发展研讨会论文集，2005-11-24.

[3]王昂，王丽丽，蒋沁，等.维生素K的生产及应用研究.河北化工杂志，2008（9）：35-37.

[4]中华人民共和国卫生部.GB 5413.10－2010 中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素K1的测定.北京：中国标准出版社，2010.