灵芝多糖的研究进展

赵 岩 张 莹 初 乐 和法涛 葛邦国 宋 烨

（1.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东 济南 250014；2.山东省轻工业设计院，山东 济南 250014）

灵芝（Ganoderma lucidum）又称灵芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株。按本草纲目记载“灵芝性平，味苦，无毒，主胸中结，益心气，补中，增智慧，不忘，久服轻身不老，延年神仙”。灵芝中通常含有多种活性物质，包括蛋白质和氨基酸、碳水化合物（主要为多糖）、脂肪和三萜类化合物、维生素和矿物质等[1]，具有很高的药用价值。灵芝多糖（Ganoderma Lucidum polysaccharides，GLP）是其中主要的一类活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老以及调节血糖等生理功能，是目前灵芝研究领域的一个热点[2]。本文就近年来灵芝多糖的制备、测定方法、结构分析以及生物活性研究的新进展进行综述。

1 灵芝多糖的提取与分离纯化

传统的灵芝多糖提取方法多为热水浸提。利用多糖溶于热水而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点，从灵芝中进行提取。大致的工艺流程为：子实体粉碎→醇提→热水回流→减压浓缩→离心→醇沉→干燥[3]。目前对于灵芝多糖的制备过程的研究主要包括提取方法（包括原料的预处理）、分离纯化和纯度鉴定。

1.1 灵芝多糖的提取

在灵芝多糖的提取过程中，多糖含量受到很多因素的影响，通过正交实验筛选，优化后工艺为：料液比1:30，提取时间3h，提取温度100℃，碳酸钠盐浓度0.5%。灵芝多糖得率由传统工艺1.027%提高至2.825%[4]。由于传统工艺存在提取时间长，得率低的问题，许多研究工作者开展微波辅助、超声波辅助萃取灵芝多糖的研究工作。超声波法提取率是索氏法的1.23倍，提取时间比索氏法缩短9倍；微波法提取率是索氏法的1.69倍，提取时间比索氏法缩短45倍[5]。顾丹健等[6]采用真空微波预处理法与传统热水提法比较，得出料液比、提取温度相同的情况下，真空微波预处理法在提取时间缩短一半的基础上，提取得率提高40.8%。与常规热水提取法相比，微波辅助提取法具有高效、节能、省时的特点[7]。超声波辅助提取中各因素对灵芝多糖得率的影响由大到小依次为：超声功率>料液比>提取温度>超声时间，灵芝多糖的最佳提取工艺为：超声功率500W，提取温度45℃，超声时间35min，料液比l:25，灵芝多糖的得率为2.75%[8]。酶解可提高多糖得率，添加1.5%纤维素酶（相对于底物），将优化后的酶法提取结果与传统热水浸提法进行比较，灵芝多糖的回收率提高19.5%[9]。

1.2 灵芝多糖的分离纯化方法

灵芝子实体、菌丝体制成的提取液中多糖浓度一般较低，需要浓缩，浓缩工艺有常压蒸馏、减压蒸馏、超滤等。绝大部分多糖在常规有机溶剂中具有较小的溶解度，所以一般采用有机溶剂将浓缩液中的多糖沉淀下来。一般将pH调至7.0左右，采用乙醇和丙酮，进行反复溶解和醇沉，可以得到部分粗多糖[10]。多糖的分离也可用季铵盐沉淀法、超滤法、酸法、Ca(OH)2沉淀法等。多糖的传统分离方法一般采用醇沉法，先将灵芝水提液进行一定程度地浓缩，按照浓缩后溶液的量加入3~4倍体积的乙醇，低温存放静置24h后，通过过滤冼涤可以得到粗多糖[11]；季铵盐沉淀法要求溶液中多糖浓度在0.1~1%为宜，过高，沉淀过程中易吸留杂质，同时浓缩成本增加；过低，微量沉淀难于回收。季铵盐沉淀法虽然分离效率高，但价格高，多糖溶液需要浓缩，沉淀多糖中残留的季铵盐也需除去[12]；张宁等[13]采用了中空纤维超滤设备来对富含游离在微生物细胞外的Ps-9415发酵液进行多糖的浓缩分离，超滤膜的截留分子量为50000，研究结果表明，料液浓度、温度、操作压力对膜通量具有明显影响，在较高的操作压力下，高温、低浓度的料液通量较大。中空纤维超滤设备具有截留效果好，通量高，浓缩充分等优点[14]。这种方法可以去除多糖提取液中的小分子物质。将另一组提取液作对照组进行透析法处理，在对原液浓度、操作压力等关键参数进行优化后，得到的样品多糖得率和含量都高于对照组。

从灵芝子实体中提取的粗多糖除杂质后在作为药物或多糖结构研究时，需要进行脱蛋白质，常用的主要有Sevag法、三氯乙酸法、三氟三氧乙烷法以及酶法结合，目前正逐渐被更简便、处理效果更好的蛋白酶与Sevag结合法以及三氯乙酸法所替代[15]。用活性炭吸附、20%过氧化氢溶液即可除去灵芝多糖中色素，但采用活性炭吸附法耗时长，多糖损失量大，采用双氧水氧化法可能破坏多糖的生物活性。曹鹏伟等[16]研究了D392阴离子交换树脂对色素静态吸附行为和热力学性质，发现其对色素的吸附等温线更符合Freundlich模型，为这一方法实际应用提供参考。通过透析法、超滤或纳滤得方法可以除去粗多糖中的低聚糖、无机盐、小分子游离蛋白和色素等杂质。

2 灵芝多糖的分析方法

灵芝多糖分级纯度鉴定的方法也比较多，有电泳法（滤纸电泳、玻璃纤维纸电泳、醋酸纤维膜电泳、聚丙烯酞胺凝胶电泳等）、超离心法、高效凝胶渗透色谱法、层析法（纸层析、葡聚糖凝胶柱层析等）等[17]。多糖物理性质的测定，如多糖分子量、溶解度、旋光性、粘度等，也影响着方法的选择。分子量测定一般采用凝胶渗透色谱法，多糖相对于蛋白质和核酸，其具有复杂的一级结构。早期利用化学分析法研究多糖的一级结构，主要采用完全酸水解法、Smith降解、甲基化法、酸或碱部分降解法、高碘酸氧化法等[18]。但由于药品消耗大、操作繁琐，逐渐采用仪器分析来代替传统方法。目前主要的仪器分析方法有：气相色谱法、高效液相色谱法、质谱分析法、核磁共振法、红外光谱法等诸多方法。对于多糖更为复杂的二级、三级结构，目前采用的研究方法有：X射线衍射、旋光谱和圆二色谱、13C-NMR及ZD-NMR、快原子轰击质谱、色质联用、酶技术-NMR等[19]。

3 灵芝多糖的结构与性质

罗立新等[20]从灵芝菌丝体和子实体水提液中分离纯化出两种多糖，采用凝胶滤过色谱得到这两种多糖的分子量分别为3.7× 104Da和4.2× 104Da。气相色谱结果测得，菌丝体多糖含D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳塘、L-岩藻糖、D-木糖、L-鼠李糖，其摩尔质量比为5.35:1.00:2.67:0.38:1.19:0.37；子实体多糖中D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-木糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖，其摩尔比为5.82:1.00:2.23: 0.72:0.51:1.35。分别采用IR、13C-NMR等手段对灵芝多糖的化学结构进行测定，确定两种多糖都是以β-(1→3)糖苷键为主链的杂多糖，在6-O和4-O上有分支，两者分支的类型和数目有所不同。Qian等[21]用高效液相分析出灵芝多糖由5种单糖和二糖组成，包括木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，其分子含量比分别是为0.4%:14.4%:12.8%:0.7%:50.9%。Ye等[22]对多糖的组分做了更深入系统的研究。采用三氟乙酸对存在于灵芝子实体中的水溶性多糖进行水解，用高效液相色谱法测得多糖分子的分子量为12000Da。利用阴离子交换层析来确定其单糖成分，测得葡萄糖：岩藻糖：半乳糖的摩尔比为1.00:1.09:4.09。Huang等[23]从灵芝子实体中分离得到一水溶性灵芝多糖，采DEAE凝胶柱和丙烯葡聚糖凝胶S-500HR分离纯化，中性多糖平均分子量约为2.5×106kDa。采用GC分析该多糖主要有葡萄糖和半乳糖构成，质量比为34:1。应用1H and 13C NMR 串联 GC–MS分析，该多糖是由1,4-双取代-β-葡萄吡喃糖和1,4,6-三取代-β-葡萄吡喃糖，支链主要由 1,6-二取代-β-葡萄吡喃糖和1,4-双取代-β-半乳鼠李糖。

从上述内容可以看出，灵芝子实体多糖种类繁多，分别为水溶性多糖、酸性多糖和碱性多糖。大部分多糖以α-(1→6)或β-(1→3) (1→6)及(1→4)为主链，其侧链种类结构大不相同，组分多样。灵芝多糖主要为杂多糖，包含D-岩藻糖、D-甘露糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖和L-鼠李糖。

4 灵芝多糖的功能研究

4.1 抗氧化作用

生物体在代谢过程中产生的氧自由基及其诱导的氧化反应对体内脂类、蛋白质、核酸、糖类等造成的氧化损害是引发炎症、心脑血管疾病、心脏疾病的重要因素，因此高效的抗氧化剂对健康具有重要意义。Chen等[24]研究了灵芝多糖对患宫颈癌的大鼠的血清中抗氧化酶和免疫反应的影响，抗氧化反应效果是通过测定DPPH自由基、氧自由基、氢氧根自由基的含量，结果表明灵芝多糖能有效提高对上述自由基的清除能力。Xu等[25]对灵芝多糖进行了羧甲基化，分别测定了水溶性、化学性质和体外的抗氧化活性，重点研究了其清除羟自由基（5mg/mL达83.7%）和过氧化氢（10mg/mL达51.6%）的能力，证明羧甲基化的灵芝多糖有更高的抗氧化活性，认为羧甲基化后的灵芝多糖可作为食品和药物制剂中作用突出抗氧化物质。Jia等[26]以威斯塔成年雄性大鼠通过注射链脲霉素诱导糖尿病，注射溶解于15% DMSO的灵芝多糖，时间为30d，结果测得大鼠注射过灵芝多糖后，体内胰岛素量、抗氧化酶量升高，脂质过氧化和血糖含量有所下降，认为灵芝多糖有明显的抗氧化性。Xie等[27]通过研究灵芝多糖在皮肤衰老基因表达水平，分析了其抗衰老作用的机制，在角蛋白细胞培养过程中用灵芝多糖处理，结果在总量18346个人基因中，103个基因的表达受到了增量调节，从而证实了灵芝多糖能诱导细胞因子的分泌进而提高有丝分裂和细胞增长的能力。

4.2 免疫调节作用

现代药理研究表明，灵芝多糖具有免疫增强作用。Yue等[28]比较了灵芝不同部位所含的多糖种类和活性，分别验证了在患有S-180肉瘤的小鼠体内，灵芝子实体不同结构（整个子实体，菌盖和菌柄）以及灵芝孢子（孢肇破损和未破损的）的抗肿瘤作用和免疫活性。实验结果表明灵芝整个子实体提取物及破壁灵芝孢子相比菌盖提取物对肉瘤的抑制作用更为明显。同时，实验还发现灵芝热水提取物及灵芝孢子在免疫刺激活性方面的效果差别不大。江振友等[29]研究观察灵芝多糖对小鼠脾淋巴细胞转化试验、NK细胞活性、DTH、碳廓清试验、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验的影响，蛄果提示灵芝多糖能提高小鼠的非特异性争特异性细胞免疫功能。Ma等[30]通过研究证实了灵芝孢子的多糖提取物能刺激脾单核细胞的增殖和细胞因子的分泌，从而体现其免疫调节活性。研究发现在灵芝孢子多糖处理的脾单核细胞中，可调控肌球蛋白轻链2-A，GDP-解离抑制因子B、T细胞特异性GTP酶、磷脂酰肌醇转移蛋白仅的表达增加。

4.3 其他作用

灵芝多糖的生物活性种类较多，除主要的免疫调节及抗氧化作用外还有抗肿瘤及抗辐射等功能。Nonak等[31]给接种MM46乳腺内瘤C3H/H的小鼠饲喂含2.5%鹿角灵芝粉（AF）的饲料，可显著抑制肿瘤生长，且延长了生存期；给接种S-180的ddy小鼠灌服AF后取得了类似的结果。同时发现，AF可防止接种MM46乳腺内瘤C3H/H小鼠局部淋巴结中IFNγ产生减少，而灵芝多糖却可通过调节免疫的机制诱导产生IFNγ，结果都是令IFNγ增加，由此可推出，免疫调节与抗肿瘤机制有一定联系。Pillai等[32]通过小鼠的生存率、网状细胞内微核的诱导、质粒pBR322DNA的丝条断裂和制止过氧化作用抑制等试验来研究灵芝多糖在体内外的防辐作用。

5 展望

近几十年来，国内外相关科技人员对灵芝多糖的提取分离、纯化、结构鉴定和保健功能等方面进行了大量的工作，并取得了不少可喜的成果，关于生物活性于构效关系方面也开始进行深入的研究。但同时我们也应当看到：一些实验研究成果与实际应用还存在一定的距离。一些提取、分离手段还仅局限在实验室，不能用于工业生产。目前国内工业化生产仍以传统工艺水提醇沉制备粗多糖为主，而高附加值的针剂产品较少。由于灵芝多糖的复杂性以及分离和分析方法的种种限制，灵芝多糖的种类至今尚未探明，其分子结构也未完全确定随着分离，纯化技术的不断创新，构效关系的不断深入，灵芝多糖会在更广阔的领域具有更广泛的发展前景。

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