基于紫贻贝Mytilus galloprovincialis表达序列的核受体家族分析

李娟 ，李崇德

（1.国家海洋局北海环境监测中心，山东 青岛 266033；2.中国科学院海洋研究所，山东 青岛 266071；3.国家海洋局北海海洋工程勘察研究院，山东 青岛 266033）

贻贝属物种在世界范围内广泛分布，并且在滨海生态系统中有着重要的作用，研究较多的物种包括 Mytilus edulis，M.galloprovincialis，M.trossulus和M.californianus等。根据英文俗称M.edulis更接近于紫贻贝（bluemussle），M.galloprovincialis因其在地中海周边分布而被称为地中海贻贝（Mediterraneanmussle）。两者在欧洲呈马赛克式分布，并在边界处存在一定程度的种间杂交。前者分布在纬度较高的地区，如苏格兰，英格兰中、北部，而后者分布在低纬度地区，如英格兰南部，法国沿海等地。M.trossulus则被认为可能是分布于欧洲更为古老物种 （Väinöläet al，1991；Varvio et al，1988）。加利福尼亚贻贝M.californianus个体较大，主要分布于北美西部沿海地区，在南美也有分布，主要生活在潮间带（Suchanek，1981）。根据2008年出版的《中国海洋生物名录》 （刘瑞玉，2008），M.galloprovincialis的中文种名是紫贻贝，也有文献称其为地中海贻贝（申望等，2011）。该物种自然分布于我国辽宁、河北、山东等省沿海地区。20世纪70年代人工养殖获得成功后，浙江多地紫贻贝养殖业发展迅速。现在紫贻贝不仅是我国重要养殖品种，也已成为世界范围研究海洋生物的种群分化、物种形成和环境监测的一个非常有意义的模式种（李巧梅等，2013；沈玉帮等，2011）。当前气候变化加剧、污染事件频发，深入研究贻贝对各种污染物及在不同胁迫压力条件下的生存状态尤为重要，而无论是对毒性物质的应激反应机制，还是生殖繁育和物种分化机制等贻贝基础生物学研究，都有赖于重要物种数据的不断积累。转录表达数据代表生物体在特定组织某一时期的基因状况，是各类生物基础问题研究的窗口。近年来，大规模cDNA测序工作在许多物种中开展，公共平台数据剧增，大量的表达数据可以部分反映相应物种转录本的结构，进而有助于探讨相应基因和基因家族的结构和特征。

核受体（nuclear receptor，NR）有时也被称为核激素受体，是一个古老的基因家族，广泛存在于腔肠动物、节肢动物和脊椎动物等各种多细胞动物中，是成员组成极复杂的一类转录调节因子。它们参与生命活动的各种功能，如体内稳态平衡、生殖、发育、代谢等（de Lera etal，2007；Germain et al， 2006； Huang et al， 2010； Laudet et al，2001）。核受体是受配体激活的转录因子，它们作为众多激素与靶位点的中间桥梁将信号分子和应答性的转录反应过程直接联系。脊椎动物中性腺激素受体以及甲状腺激素受体都是这一基因家族的成员。核受体基因家族的大部分成员具有共同的结构特点，一个典型的核受体分子从N端至C端分可以为A/B功能区、C区、D区和E区。A/B功能区的可变性最大，其中包含至少一个非配体依赖性的转录激活位点即激活功能元件1（active transactivation region（AF-1））和几个自助转录激活区（transactivation domains（AD））。位于特定位置的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基能受不同信号转导通路相关激酶作用而磷酸化，从而影响受体与配体的亲和力和转录活性。核受体最保守的是C区中的DNA结合区（DNA-binding domain，DBD），及E区中的配体结合区（ligand binding domain，LBD），C区与E区之间是保守性较差的作为铰链连接它们的D区。E区为多功能区，是核受体最大的部分，包括数个亚区和基序，除配体结合口袋（ligand binding pocket，LBP），E区还含有核受体二聚体化区和配体依赖性转录激活功能元件2（AF-2）（Robinson-Rechavietal，2003）。总体来说，DBD和LBD是核受体中两个最保守的结构域，也往往被用作核受体基因鉴定和分类的典型结构序列。为了避免不同物种核受体家族成员名称的混乱，1999年由国际药理学委员会和受体命名与药物分类联合会专门成立了核受体命名委员会并在Cell发文提出核受体系统命名法则（Nuclear Receptors Nomenclature Committee,1999）。此后发现的新的核受体家族成员也都按此规则再进行系统性的命名。尽管结构相似，核激素受体却有着与类固醇激素，成型素（维甲酸）、食物组分（脂肪酸）等不同化合物结合并调控下游通路的能力，在生物体内多种多样的生理功能、代谢途径中行使着重要的作用（Escriva etal，2000；Robinson-Rechaviet al，2001）。

本研究通过对公共数据库中紫贻贝M.galloprovincialis转录数据的拼接和比对，以模式物种核受体特征序列为参考获取紫贻贝核受体的编码序列，进一步通过系统进化分析明确编码产物的结构和在基因家族中的进化位置，从而全面分析该物种这一重要基因家族的组成和结构。本研究不仅为研究紫贻贝核受体功能研究提供宝贵信息，也有助于紫贻贝遗传分化、生长繁育等生物问题的深入探讨。

1 材料与方法

1.1 紫贻贝转录数据的预处理

通过NCBI（NationalCenter forBiotechnology Information）EST数据库搜索，目前紫贻贝（M.galloprovincialis）共有19 617条EST序列。在EBI（The European Bioinformatics Institute）的 ENA（European Nucleotide Archive）数据库 （M.galloprovincialis）有60 282条序列。将上述序列下载，并以各核受体基因名称为关键词搜索公共数据库中该物种的核酸和蛋白序列。通过Cross_match去除EST数据的载体序列，使用软件Cap 3对所有序列进行拼接构建本地紫贻贝核酸数据库。

1.2 紫贻贝核受体预测

下载人的48个核受体基因编码蛋白序列（人的核受体在不同亚家族都有分布并具代表性），通过PFAM结构域分析，使用bioperl提取最为保守的DBD结构域和LBD结构域序列，对已进行拼接的紫贻贝核酸数据库进行本地tBLASTn。无论之前是否有基因注释，对所有E-value小于0.001的序列进行BLASTx同源基因比对并采用InterPro程序（http：//www.ebi.ac.uk/interpro）进行蛋白结构预测。

1.3 系统进化分析

将紫贻贝核受体与人Homo sapiens、果蝇Drosophilamelanogaster核受体序列的DBD和LBD结构域序列（根据PFAM数据库预测）分别提取形成构建系统进化树的序列文件。相关的GenBank序列码为：CAA31709，AAF51627，CAA34626，AAN11687， AAF51692， AAA28461， AAF52702，AAC46928， AAF45707， Q24142， AAB71371，AAF58145， AAF52303， AAF54133， AAL37554，AAF53914， AAN11667， AAN11107， AAX73355，AAH11564， AAH30207， AAH08851， AAI06931，AAH08727，AAH60794，AAA63254，AAB32649，AAA36469，AAH06811，AAH56148，AAH45613，AAH08831，AAH93774，AAA64751，AAV38218，NP_009052， AAI30574， AAB95155， AAD05436，AAY56401，NP_849180，NP_004124，AAI10999，AAC18599，AAA80681，AAA36761，NP_003289，AAL05871，AAD28301，AAH04154，AAH42897，AAH02669， AAI28575， AAV31779， AAH63795，AAC99409，EAW93335，AAH15610，AAA59571，AAA60081，EAX05380，CAG32985，AAH09288，CAI95138， AAH32501， AAI18572， AAB96828。通过CLUSTALX进行蛋白序列的比对，辅以手工校正。以贝叶斯推断法（Bayesian Inference）进行系统进化分析。贝叶斯系统进化树采用MrBayes 3.2.1软件构建（Ronquistetal，2003；Ronquistet al，2012）。起始树设为随机树（random），马尔科夫链的蒙特卡洛方法（Markovchain Monte Carlo process，MCMC）设置为4条链（3条热链，l条冷链）同时运行5×106代，每100代对系统树进行抽样，最终得到50 001棵系统发育树，burnin frequency为10%以确保MCMC的收敛。

2 结果与讨论

2.1 紫贻贝中核受体序列

在预处理的紫贻贝转录数据中，共获得29条能够编码核受体特征序列（DBD或LBD）的转录本，最短的编码49个氨基酸，最长的编码678个氨基酸，命名为类核受体成员MgNRl1-29。根据InterPro程序分析，其中10条序列编码1个DBD和1个LBD结构域，12条序列只有1个DBD特征序列，6条序列只有LBD特征序列，值得注意的是，我们发现1条编码2个DBD的转录本（MgNRl6），在其C端是1个不完整的LBD序列，形成DBD1-DBD2-LBD结构。Wu等（2007）在曼氏血吸虫Schistosomamansoni中首次发现了这类新的非典型的核受体成员，相似的核受体在涡虫Schmidtea mediterranea和 Dugesia japonica、帽贝Lottia gigantea中也存在，这提示核受体与靶基因DNA序列的相互作用可能存在新的机制。

图1多序列比对结果显示，不同DBD结构域之间的序列相似性较高（包括MgNRl6的2个DBD结构域），大部分含有8个保守的半胱氨酸氨酸残基，并形成了两个锌指结构，即C-X2-CX13-C-X2-C（锌指 1）和 C-Xx-C-X9-C-X2-C（锌指2），每个锌指由4个半胱氨酸和中心部位的一个锌离子鳌合而成，这与其它的典型核受体的DBD结构相同，是与特定DNA位点结合的部分。锌指1相关的P-box也十分保守，参与核受体与DNA结合的过程。锌指2相关的D-box则相对多变，这是在核受体自身及与其它成员二聚化中起作用的结构，两个保守半胱氨酸之间的氨基酸5-7个不等。在S.mansoni中D-box此处（Xx）有3-9个氨基酸（Wu etal，2011）。另一重要结构域LBD不及DBD保守，但它们的高级结构十分相似，都是由 12个 α 螺旋构成的 （Moras et al，1998）。LBD是响应内外激素或其他配体信号的功能域。已有的研究普遍认为，配体结合特性是在核受体的进化过程中获得的（Bertrand et al，2004）。有的LBD不具有功能性的LBP，无法结合配体，可能是真正的孤儿受体（Baker etal，2003；Codina et al，2004；Flaigetal，2005）。

图1 紫贻贝核受体DNA结合结构域的多序列比对

2.2 系统发育分析

本研究通过构建贝叶斯系统进化树对紫贻贝核受体进行分析。贝叶斯推断法和最大似然法（Maximum Likelihood）紧密相关，不过它衡量分支的支持率所用的MCMC法要比似然法的自展法速度快，已经在大数据量的分子进化分析广泛应用（Huelsenbeck et al，2001）。因核受体家族是一个古老的成员众多的基因家族，借鉴蚤状溞Daphnia pulex基因家族分析方法，采用了中点定根法（Thomson etal，2009）。如图2所示，根据DBD序列构建的贝叶斯树中，NR0、NR3、NR4亚家族及NR2的主要组别分别汇到一起，NR5和NR6亚家族汇成一支，而NR1亚家族的成员分散分布。根据LBD序列构建的贝叶斯树中，7个亚家族成员分别聚合，形成更为清晰的分支，最后聚到一起。27个紫贻贝核受体的进化关系较为明确，其中属于NR1亚家族的序列最多，为19个，占65.5%，其中包括HR96、E75、ROR以及2DBD-NR的同源基因；5个属于NR2亚家族，包括HNF4、RXR、TLL、SVP的同源基因；2个属于NR3亚家族，分别与ESR、ERR同源；还有1个属于NR5亚家族，与人NR5A2最为相近。我们在分析过程中发现一些核受体的部分序列极其相似，但临近序列差异较大，推测可能是同一基因由于可变剪切产生的不同转录本（例如MgNRl26和MgNRl27）。已经进行全基因组测序的长牡蛎Crassostrea gigas的核受体成员就普遍存在可变剪切现象。但根据现有的数据不能完全排除由不同拷贝的同源基因分别转录形成或不同个体发生变异产生的可能。

在软体动物核受体的相关研究中，最受关注的是ESR（estrogen receptor，雌激素受体）和RXR（retinoid X receptor，维甲酸X受体）。很多软体动物都具有雌激素受体同源基因，紫贻贝核受体MgNRl23在进化关系上也与人雌激素受体十分接近，但目前一般认为软体动物的ESR同源基因并不像高等动物那样能够与雌激素特异结合。海兔中ESR同源基因的研究表明其能与多种类固醇及外源物质发生作用，可能作为感受器存在（Thornton etal，2003）。一些软体动物中这一核受体是组成型表达的并且似乎与雌激素并不结合（Baker etal，2007；Keay etal，2006；Thornton etal，2003）。章鱼ESR同源基因的分子结构模型研究显示存在空间冲突使它不可能与雌激素结合（Baker et al，2007）。腹足类软体动物作为内分泌干扰模型被广泛研究，一些种类对环境污染物有机锡非常敏感，雌性个体会被诱导形成雄性性器官和输精管，出现性 逆 转 （imposex）现 象 （Gibbs et al，1988；Horiguchietal，1997）。RXR在三丁基锡诱导的蚵岩螺Thais clavigera中表达上调，特别是在卵巢和性逆转形成雄性性器官的组织中（Horiguchietal，2010）。对荔枝螺Nucella lapillus、凤螺Babylonia japonica、鲍Haliotismadaka以及H.gigantea的研究均支持RXR在有机锡诱导腹足类性逆转机制中发挥着重要作用（Codina et al，2004；Horiguchi，2006）。紫贻贝的类雌激素受体、类维甲酸X受体及其它核受体的生理作用，对毒性物质的应激反应机制还有待更深入的功能性研究。

图2 核受体的贝叶斯系统进化树

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