胰岛素抵抗动脉粥样硬化小型猪模型的研究

马毅超，潘永明，陈 亮，陈方明，杨涛涛，陈民利

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心，杭州 310053)

随着社会经济的高速发展，近年来我国糖尿病的发病率呈流行、上升趋势；据报道，我国成年人糖尿病的患病率高达11.6%，约1.14亿人，几乎占据了全世界总患病人数的一半，糖尿病的治疗与防治已成为我国的重大公共卫生问题之一，研究还表明，我国每年以胰岛素抵抗为发病基础的2型糖尿病的发病率以12%的增长率显著上升，且是患者致残致死的重要因素[1]。同时，已有研究证实，2型糖尿病致死的主要原因可能与其伴随发生严重的动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)有关[2]。因此，建立理想的胰岛素抵抗动脉粥样硬化疾病动物模型对于促进2型糖尿病病因或疾病机制的研究具有重要意义。

目前，糖尿病动脉粥样硬化模型的建立大多采用转基因小鼠或大鼠进行，但单基因敲除的动物和鼠类对高脂具有抗性，很难形成AS等特点，使其不能完全模拟人类疾病多基因作用的发病特点和动脉粥样硬化的程度不高等缺点[3]。因此，寻找和筛选理想的实验动物并建立相应的动物模型，对于发病机制和临床前药物的评价研究具有重要的支撑作用。已有研究发现，小型猪的心脏大小和冠脉循环与人类相似，特别适合运用于心血管疾病方面的研究[4]。中国小型猪资源丰富，包括有藏猪、五指山小型猪、巴马小型猪、贵州香猪等；本研究团队前期研究发现，藏猪[Susscrofa]高脂诱导后发生血管脂质沉积同时出现高血压和糖耐量异常现象，是一种建立胰岛素抵抗AS模型的理想的实验动物。为此，本研究通过观察高脂诱导后藏猪的糖脂代谢和胰岛素敏感性的变化，探讨藏猪胰岛素抵抗AS模型的病症特点。

1 材料和方法

1.1 实验动物

普通级4 ～ 5月龄雄性藏猪，体重为12 ～ 16 kg，12只，由南方医科大学实验动物中心提供【SCXK(粤)2011-0015】；饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心普通级小型猪实验室[SYXK(浙)2008-0116]，环境温度：22±1℃，相对湿度：40% ～ 65%，自由饮水，12 h/12 h明暗交替。

1.2 仪器与试剂

日立7020型全自动生化仪(日本日立公司)、Nikon生物倒置显微镜(日本Nikon公司)、冰冻切片机(德国Leica公司)、自动染色机(德国Leica公司)、大动物无创生物信号遥测系统(法国EMKA公司)、50%葡萄糖注射液，购自上海信宜金朱药业有限公司，高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、血糖(GLu)果糖胺(FMN)试剂盒购自购自上海申能德赛诊断技术有限公司，猪胰岛素ELISA试剂盒、血清胰岛素试剂盒购自上海信然有限公司。

1.3 动物分组及AS模型的建立

藏猪适应性饲养观察后，行前腔静脉穿刺取血，测定血液生化和血常规等各项指标无异常者后，开始正式实验。将藏猪按其体重和糖脂代谢水平分成正常对照组和AS模型组，正常对照组4只，AS模型组8只，正常对照组饲喂基础饲料，AS模型组饲喂高脂饲料(高脂饲料配方：1.5%胆固醇、15%油脂、10%蛋黄粉、0.5%食盐、73%基础饲料)，各组均按体重2.5%饲喂饲料，每2周称重调整饲喂量，连续造模24周后处死，行组织形态学观察。

1.4 指标观察

1.4.1 血液生化指标检测 分别在造模前(0周)、造模后2、4、8、12、16、20、24周时，禁食12 h后，取前腔静脉血2 mL，3000 r/min离心10 min，分离血清，测定TG、CHOL、HDL-C、LDL-C、并计算动脉粥样硬化指数AI，AI=(总胆固醇-高密度脂蛋白)/高密度脂蛋白。同样方法测定第4、8、12、16、20、24周时FMN、Glu含量和血清胰岛素(Ins)含量。

1.4.2 糖耐量试验 分别在造模后8周、16周、20周、24周时进行糖耐量试验。各组藏猪禁食16 h后，取耳缘静脉血1 mL，随后从耳缘静脉注射50%葡萄糖注射液，注射量为1 mL/kg，2 min内注射完毕，检测给糖前(0 min)、给糖后15、30、60、90和120 min时的血糖变化，并计算血糖曲线下面积(AUC)，AUC=1/8×BG (0 min) +1/4×BG(15 min)+3/8×BG(30 min)+1/2×BG(60 min)+1/2×BG(90 min)+1/4×BG(120 min)。

1.4.3 胰岛素抵抗特性评价 利用稳态模型评价(HOMA)指数中的胰岛素抵抗指数(HOMA- IR)和胰岛β细胞功能指数(HOMA-IS)，评价动物胰岛素抵抗情况。计算公式为HOMA-IR=FPG(空腹血糖)×FINS(空腹胰岛素)/22.5，HOMA-IS=1/FPG×FINS。

1.4.4 动脉血压及左心室功能的测定 造模24周后，耳缘静脉注射1 mL/kg 3 %戊巴比妥钠溶液麻醉动物，行股动脉分离术，分离股动脉并导管插管，连接血压换能器，在EMKA大动物无创生理信号遥测系统监测藏猪血压的变化，并记录舒张压(DBP)、收缩压(SBP)和平均动脉压(MBP)以及心率(HR)、左心室压(LVSP)、左室最大变化速率(±dp/dtmax)、左室舒张期末压(LVEDP)。

注：与正常对照组比，*P < 0.05，**P < 0.01。

1.4.5 腹主动脉大体观察和病理组织学观察

造模结束后，处死藏猪，取腹主动脉、冠状动脉、颈动脉，观察动脉脂质沉积和斑块形成情况，并行油红“O”染色，观察动脉病变程度。腹主动脉血管进行冰冻切片成4 mm的薄片，HE染色，显微镜下观察病理变化并拍照。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 高脂诱导后藏猪空腹血糖和果糖胺的变化

高脂诱导后，AS模型组藏猪的空腹血糖从第8周开始高于正常对照组，并在造模后第16～24周时显著升高(P< 0.05，P< 0.01)。另外，AS模型组藏猪空腹果糖胺含量从第4周开始就发生显著性升高，并在整个造模期间内均显著高于正常组(P< 0.01)。(图1)。

2.2 高脂诱导后藏猪模型糖耐量试验结果

高脂诱导后进行葡萄糖耐量试验发现，造模8周后AS型组藏猪耳缘静脉注射葡萄糖2 h后血糖仍显著高于正常对照组(P< 0.05)，并且糖耐量曲线面积略高于正常对照组(P> 0.05)。同时，AS模型组藏猪造模16 ～ 24周时糖耐量曲线下面积逐渐增高并显著高于正常对照组(P< 0.05，P< 0.01)；且在造模第24周时AS模型组藏猪在15～90 min时血糖均显著高于正常对照组(P< 0.05，P< 0.01)(表1)。

2.3 高脂诱导后藏猪HOMA-IR和HOMA-IS指数的变化

高脂诱导后，AS模型组藏猪HOMA-IR指数在造模4周开始出现升高，并在造模第16～24周时升高显著(P< 0.05，P< 0.01)，而HOMA-IS指数则在造模4后开始降低，并在造模后第20～24周时显著低于正常组(P< 0.05)(图2)。

2.4 高脂诱导后藏猪血脂水平和AI指数的变化

高脂诱导后，藏猪AS模型组血清CHOL、HDL-C和LDL-C水平均从造模第2～24周时均显著高于正常对照组(P< 0.01)并在第4周达到高峰值，而TG水平在造模过程中与正常对照组无明显差异(P>0.05)(图3)。另外，高脂诱导后AS模型组在造模期间AI指数均显著高于正常对照组，其中造模第4～24周时差异显著(P<0.05，P<0.01)(表2)。

表1 造模期间藏猪糖耐量试验结果(mmol/L)

注：与正常对照组比，*P < 0.05，**P < 0.01。

注：与正常对照组比，*P < 0.05，**P < 0.01。

表2 造模期间藏猪AI指数检测结果

Tab.2 The results of Tibetan pig AI index during modeling

注：与正常对照组比，*P < 0.05，**P < 0.01。

表4 藏猪左心室功能指标的测定结果

2.5 高脂诱导24周后藏猪的血压和左心室功能指标

造模24周后，AS模型组的藏猪MBP和SBP均显著升高(P< 0.05，P< 0.01)，DBP有升高趋势，但无显著性差异(P> 0.05)(表3)。AS模型组左心室功能指标发生显著性变化，LVEDP、dPdt+、dPdt-与正常组相比均有显著性差异(P< 0.05，P< 0.01),AS模型组的HR也有上升趋势，但无显著性差异(P> 0.05).

2.6 藏猪动脉血管大体观察和病理组织学观察结果

造模24周后处死动物，观察腹主动脉、冠状动脉及颈动脉脂质沉积和粥样硬化情况。结果显示藏猪AS模型组除颈动脉外，冠脉和腹主动脉均发生较明显的脂质沉积和粥样硬化，其中腹主动脉粥样硬化程度更为严重。大体观察和油红“O”染色显示，正常对照组腹主动脉内皮光滑，无红色脂质条纹沉积；AS模型组腹主动脉出现黄白色脂类物质的沉积，并出现明显的红色脂质条纹染色，沉积严重者厚度达1 cm。HE染色结果显示，正常对照组腹主动脉内膜光滑，无明显增厚和炎性细胞浸润，平滑肌排列整齐；AS模型组腹主动脉内膜增厚，有皱褶，出现大量的炎性细胞浸润和聚集，平滑肌排列紊乱(彩插7图4)。

3 讨论

临床上，胰岛素抵抗主要表现为以肥胖、血糖升高、血脂紊乱、糖耐量异常、高血压为特点的代谢综合征[5]。本实验中，我们观察了高脂诱导下藏猪在造模24周中不同时间点空腹血糖、果糖胺、血脂和糖耐量的变化。图1的结果显示，正常对照组和AS模型组在造模初期空腹血糖值较高，这可能与造模初期藏猪年龄较小在抓取过程中易产生应激有关。在造模中后期，藏猪年龄增大，适应了取血环境，应激变小，正常对照组血糖降至正常水平，反观AS模型组藏猪血糖仍处于较高水平并显著高于对照组(P< 0.05，P< 0.01),说明高脂诱导后，藏猪出现了血糖升高的现象。为进一步确定藏猪血糖的控制状况，本实验还测定了24周中藏猪的FMN的变化情况，FMN的测定被认为是一项简便、快速并能准确反映糖尿病血糖控制的指标。实验发现AS模型组的FMN从第4周开始就发生显著升高(P< 0.01),此外AS模型组藏猪的糖耐量亦发生明显的异常糖耐量曲线下面积显著升高，呈现出胰岛素抵抗的特征。

为进一步评价模型胰岛素抵抗的程度，我们采用了Matthews等[6]提出的稳态模型(HOMA)来测定动物的胰岛素β细胞分泌指数，其中胰岛β细胞分泌指数还可以反应动物对胰岛素的敏感性，此法简单实用，是评价胰岛素抵抗的金标准方法。结果显示，高脂诱导后藏猪的HOMA-IR指数的水平上升并在造模后期明显高于正常对照组，同时模型组HOMA-IS指数并不增高，后期显著低于正常对照组。综合糖耐量、血脂和HOMA指数的结果，高脂诱导藏猪可能发生明显的胰岛素抵抗并伴有胰岛β细胞的功能障碍。另外，AS模型组藏猪血压发生了显著性升高，这可能也与其血清胰岛素水平较高并发生了胰岛素抵抗有关。研究表明，胰岛素抵抗后血清胰岛素升高，易发生高胰岛素血症，高胰岛素会通过不同的方式促进血压的上升，如促进交感神经活动增强，促进血管紧张素Ⅱ的分泌，引起血管平滑肌增生、迁移等[7-8]。

本实验还发现，高脂诱导后，血脂发生了明显异常。AS模型组的藏猪血清CHOL、HDL-C、LDL-C的含量从造模第2周后已显著高于正常对照组并在第4周达到高峰值，说明藏猪对高脂饲料十分敏感。研究发现，血液中的CHOL升高后易造成血管壁增厚使白细胞不易通过，无法去杀细菌，同时大量CHOL还会沉积在血管壁造成血液循环不良，严重时还会发生血管破裂，形成动脉硬化[9]。高脂模型组的动脉硬化指数上升符合这一说法，但高脂组模型AI在最后一周较正常对照组并没有显著升高，但从解剖结果来看，藏猪动脉已发生了较严重的粥样硬化，这可能与饲养时间长使动物适应了高脂饲料以及动物自身生长需要对脂质的吸收转化为能量供应需求，从而导致血清CHOL有所下降有关。值得一提的是，AS模型组的血清HDL/C和LDL/C的在第4周达到高峰值后便呈现先下降趋势，其中LDL/C下降较为明显，其原因可能有以下两个方面：一是，在第4周后，藏猪逐步从高脂血症像动脉粥样硬化炎症发展，藏猪食欲下降，高脂饲料摄入量逐月递减，导致血清CHOL相应下降，而LDL/C在脂蛋白中所占比例较大，HDL/C则较小，由于造模时间短，AS的形成较临床上更快，故CHOL的下降首先直接导致了LDL/C的下降。二是，有研究表明，动脉粥样硬化斑块中的脂质沉积主要为LDL/C[10]，同样因为造模时间短的原因，在造模中后期，血管壁上LDL/C积极沉积，导致了血清LDL/C的下降。心脏血流动力学的指标中，AS模型组藏猪的LVEDP发生了极显著的升高，LVEDP的上升说明了藏猪的左心室前负荷增加；±dp/dtmax的增高也说明了心脏收缩性能的增强[11]，心脏泵血增强，也从侧面反映了血管可能出现硬化，导致血流不畅。

高脂诱导藏猪发生胰岛素抵抗的同时出现了较为明显的动脉粥样硬化的病变，这与临床上报道的2型糖尿病患者有很强的致动脉粥样硬化趋势相符[12]。徐雷等[13]研究发现，使用高脂饲喂糖尿病模型GK大鼠后，并未出现明显的动脉粥样硬化；其他一些学者使用小鼠进行造模时，虽然能够出现胰岛素抵抗的症状但都不易发生动脉粥样硬化，HDL-C也偏高。另外使用小鼠模型时还存在难以反复采血和动脉血管的切开的问题[14-15]。而本试验使用高脂诱导藏猪模型很好的解决了这些问题，AS模型组的藏猪动脉粥样硬化斑块明显，HE染色出现平滑肌增生，排列不规则，出现典型粥样硬化的病理变化。

综上所述，本研究采用高脂诱导建立的藏猪胰岛素抵抗动脉粥样硬化模型，主动脉脂质沉积和粥样硬化程度明显，并伴有明显的高血压、高血脂、糖耐量异常等胰岛素抵抗的代谢综合征，各项指标较其它模型更符合临床表现，是一种研究胰岛素抵抗动脉粥样硬化的理想的模型。

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