雪貂感染H7N9禽流感病毒动物模型的建立

邓 巍，许黎黎，鲍琳琳，朱 华，陈 霆，吕 琦，李枫棣，袁 静，向志光，高 凯，徐艳峰，黄 澜，李彦红，刘江宁，姚艳丰，于 品，秦 川

(中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

2013年3月在中国东部地区爆发了H7N9禽流感疫情，患者的主要表现为进行性重度肺炎和呼吸困难[1]。截止至8月6日，全国10省市发生人感染H7N9禽流感病例132例，其中死亡43人。因此在疫情不断发展的情况下，迅速建立该疾病的实验动物模型，为H7N9禽流感发病机制研究、疫苗及药物的评价提供实验基础是必要而迫切的。自1933年以来雪貂因其对人和禽流感病毒易感，就一直被用作流感模式动物[2]。 感染流感病毒后，雪貂的呼吸道症状以及肺部病变与人类十分相似[3]。本实验利用雪貂(Mustela putorius furo) 成功建立了H7N9感染的实验动物疾病模型。

1 材料与方法

1.1 病毒

流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9) 来自于第3例确诊的H7N9患者，接种9～11 d SPF 鸡胚，然后在MDCK细胞上传代一次。

1.2 细胞

MDCK细胞购自ATCC，无支原体污染，细胞用MEM培养基培养(MEM, Invitrogen)，培养基内加入10%的胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素，培养条件为 37℃，5% CO2。

1.3 动物感染及标本采集

9只SPF级雪貂购自中国医学科学院医学实验动物研究所，6～12月龄，所有动物血清对流行的流感病毒的血凝抑制(HI)试验检测结果均为阴性。雪貂分2组，第一组3只，每只动物滴鼻感染400 μL 108TCID50的A/Anhui/1/2013 (H7N9)病毒，每天进行CT肺部扫描查；第二组6只动物，每只动物滴鼻感染400 μL 106TCID50的A/Anhui/1/2013 (H7N9)病毒，在感染后的第3、第7天分别随机安乐死1只动物，对其气管、肺、脑、心脏、肝脏、脾、肾、胃、十二指肠以及嗅球进行病理及病毒学检测。所有9只雪貂每天记录临床症状及体重，分别在感染后第1，3，5，7，9天采集感染雪貂的鼻拭子和咽拭子，保存于1 mL PBS中，并接种于MDCK细胞，测定病毒滴度。

本实验由北京协和医学院医学实验动物研究所动物使用和伦理委员会批准(ILAS-PC-2013-009)。所有的实验都按照WHO指导原则在ABSL-3实验室内进行(许可证号：ABSL3-021，CANS BL0010)。

1.4 病毒滴度

本实验采用MDCK细胞测定病毒的滴度。10倍系列稀释的各组织匀浆、鼻拭子、咽拭子接种于单层MDCK细胞中，37℃ 孵育1 h后，用PBS洗一次，并加入200 μL病毒培养基(MEM培养基中加入100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素和1 μg/mL 胰蛋白酶)，接种后第3天，收集被感染细胞上清，用火鸡血测定凝血活性，以此判定细胞是否被感染。利用Reed-Muench 计算组织细胞半数感染量(TCID50)[4]。

1.5 组织病理和免疫组化

根据标准操作规程进行动物尸检，组织置于10%福尔马林中固定，石蜡包埋，4 μm 连续切片，苏木精-伊红(H&E)染色，光学显微镜检查。免疫组化使用抗甲型流感病毒核蛋白的单克隆抗体(1∶200稀释, IRR 公司, 货号: FR-51) 4℃过夜，PBS洗涤3次，加入HRP标记的羊抗小鼠二抗(1∶5 000稀释，Sigma公司，货号：PV-9002)，加入3-3-二氨基联苯胺 (DAB)，光学显微镜观察。

1.6 血细胞分析

采集每只动物外周血保存于肝素抗凝管内，利用ACT TM(贝克曼公司，美国)血常规仪对血样本进行血细胞计数分析。

1.7 Micro-CT扫描

使用Micro-CT扫描仪(西门子医疗公司，德国)观察雪貂肺部情况，感染雪貂麻醉后平躺在CT床上，保持呼吸通畅。管电压为70 kV，电流为400 mA，曝光时间为800 ms，扫描范围(FOV)为72.44 mm×71.31mm。通过单球管/探测器CT系统以步进1度旋转360度以获得图像投影。使用市售的滤波反投影技术成像软件(COBRA Exxim, v6.3) 进行图像重建。

1.8 血凝抑制试验(HI)

使用0.5%的火鸡血进行雪貂血清的血凝抑制试验实验。采集雪貂外周血，分离血清，按照WHO颁布的标准HI测定方法测定收集的血清对H7N9病毒的血凝抑制价[5]。

1.9 统计分析

雪貂的体重、病毒拷贝数以及病毒滴度在不同组之间存在的差异进行ANOVA单因素方差分析和Bonferroni校正分析。两组之间的差异运用SPSS 11.5 软件包中的t-test进行分析。P<0.05时，两者之间存在显著性差异。

2 结果

2.1 症状和体征

两个感染剂量组的雪貂均表现出发热，体重下降，打喷嚏，流鼻涕，嗜睡(封底图1A和1B，表1)，食欲下降。在感染后14 d的观察期内，108剂量组的雪貂体温最高可达到40.0℃(感染后第2天)体重降低程度最高可达10.7%(感染后第7天)，106剂量组的雪貂则分别为40.1℃(感染后第4天)和9.3%(感染后第5天)(图2A和2B)。

此外，108剂量组的3只雪貂CT扫描结果显示，感染后第6～14天，在肺的左上叶、右上叶以及右中叶可见片状炎症阴影(封底图1C)。

2.2 血液学变化

临床报道感染H7N9病毒的患者白细胞数量下降[1,6-7]。在感染后第7天雪貂外周血检测发现雪貂淋巴细胞明显减少，而中性粒细胞增加明显(P<0.05) (表2)。

2.3 动物排毒情况

感染后第1，3，5，7，9天采集感染雪貂的鼻拭子和咽拭子，接种MDCK细胞进行病毒滴度的测定。感染后第1天两个剂量感染雪貂均开始排毒，一直持续到感染后第7天。两个剂量上呼吸道排毒的峰值分别出现在感染后第3天的咽拭子(108剂量组)，滴度到达104.38TCID50/mL，以及感染后第5天的鼻拭子(106剂量组)，滴度为104.11TCID50/mL(图2C)。

2.4 解剖及病理学变化

感染后第3和第7天随机安乐死一只感染106TCID50H7N9禽流感病毒的雪貂，对其气管、肺、脑、心脏、肝脏、脾、肾、胃、十二指肠以及嗅球进行病理及病毒学检测。组织病理学分析显示雪貂肺组织于感染后第3天出现多病灶的轻度间质性肺炎，感染后第7天肺组织可见局灶性间质性肺炎及肺泡炎样改变，病灶出现增大、熔合的现象(封底图3C和3D)。另外，免疫组化结果显示H7N9禽流感病毒可同时感染雪貂支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞 (封底图3A和3B)。

注：图A、B、C分别为雪貂感染后平均体温、平均体重、及上呼吸道排毒平均水平。

表1 雪貂感染H7N9禽流感病毒后的临床症状以及各组织病毒复制情况

表2 雪貂感染H7N9禽流感病毒后的血像变化情况

2.5 病毒在体内分布情况

将感染后第3、7天的雪貂各组织匀浆，接种MDCK细胞，测定病毒滴度。结果显示在感染后第3天肺、气管、心脏、嗅球可检测到活病毒，而在感染后第7天肺、气管、肝脏可检测到活病毒(表1)。H7N9禽流感病毒可在神经系统(嗅球)复制的特性与高致病性禽流感H5N1，H7N7相似[8-10]。

3 讨论

综上，H7N9禽流感病毒可感染雪貂，引起动物出现典型的打喷嚏、发热等临床症状和体征，可检测到上呼吸道排毒及肺、气管、嗅球等组织内的病毒复制情况，组织病理学变化可见肺组织炎性改变。雪貂感染H7N9禽流感病毒后的变化与人感染后的变化是相似程度较高[11-13]，说明雪貂可作为H7N9感染模型动物之一。雪貂感染H7N9模型动物的建立可为H7N9致病机制研究、治疗药物和疫苗的评价提供科学的动物模型基础。

参考文献：

[1] Gao R, Cao B, Hu Y, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus [J]. N Engl J Med. 2013, 368(20):1888-1897.

[2] Smith W, Andrewes CH, Laidlaw PP. A virus obtained from influenza patients [J]. Lancet 1933, 222:66.

[3] Maher JA, DeStefano J. The ferret: an animal model to study influenza virus [J]. Lab Anim (NY) 2004, 33(9):50-53.

[4] Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints [J]. The American Journal of Hygiene 1938, 27(3):493-497.

[5] World Health Organization Gisn. Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza [M]. Geneva, Switzerland: World Health Organization. 2011:140.

[6] Chang SY, Lin PH, Tsai JC, et al. The first case of H7N9 influenza in Taiwan [J]. Lancet 2013, 381(9878):1621.

[7] Chen Y, Liang W, Yang S, et al. Human infections with the emerging avian influenza A H7N9 virus from wet market poultry: clinical analysis and characterisation of viral genome [J]. Lancet 2013, 381(9881):1916-1925.

[8] Blisard KS, Davis LE. The sequence of changes in liver and brain in the influenza B virus mouse model of Reye’s syndrome [J]. J Neuropathol Exp Neurol. 1990, 49(5):498-508.

[9] Hodgson NR, Bohnet SG, Majde JA, et al. Influenza virus pathophysiology and brain invasion in mice with functional and dysfunctional Mx1 genes [J]. Brain Behav Immun. 2011, 26(1):83-89.

[10] Shinya K, Suto A, Kawakami M, et al. Neurovirulence of H7N7 influenza A virus: brain stem encephalitis accompanied with aspiration pneumonia in mice [J]. Arch Virol. 2005, 150(8):1653-1660.

[11] Belser JA, Gustin KM, Pearce MB, et al. Pathogenesis and transmission of avian influenza A (H7N9) virus in ferrets and mice [J]. Nature. 2013, 501(7468): 556-559.

[12] Watanabe T, Kiso M, Fukuyama S, et al. Characterization of H7N9 influenza A viruses isolated from humans [J]. Nature. 2013, 501(7468): 551-555.

[13] Zhu H, Wang D, Kelvin DJ, et al. Infectivity, transmission, and pathology of human H7N9 influenza in ferrets and pigs. Science 2013, 341(6142):183-186.