低浓度84消毒液对小鼠生殖生理的影响

胡 玉，田 韵，周 丽，周 军，丁志刚

(中南大学湘雅三医院医学实验中心，长沙 410013)

84消毒液是含氯的次氯酸钠溶液，具有广谱、高效、快速的杀菌作用。目前动物实验室多采用独立通气笼盒( individually ventilated cages, IVC)系统，而84消毒液是浸泡IVC笼具的常用消毒液之一。84消毒液用于IVC笼具的消毒效果已有报道[1]，但对于84消毒液对实验动物生殖生理的影响未见报道,因此，本实验使用84消毒液对KM小鼠生殖生理的影响进行研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级KM小鼠72只，雌雄各半，4周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司【SCXK(湘)2011-0003】。饲养在中南大学湘雅三医院动物实验中心【SYXK(湘)2010-0001】，整个实验过程严格遵守医院实验动物中心标准操作规程，并且善待实验动物。

1.2 实验试剂与仪器

84消毒液(湖南湘雅集团有限公司，有效氯含量：4.0%～7.0%)；小鼠睾酮(T)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒、小鼠雌二醇(E2)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒，购自上海江莱生物科技有限公司；丙氨酸转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)试剂盒，购自广州瑞宇生物科技有限公司；日立 LABOSPECT 003全自动生化分析仪，日本日立公司；电子天平(湖南湘仪，TP-620A)等。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组及处理 72只KM小鼠，经1周适应性饲养后，随机分为3组：2个剂量组(A组、B组) 和生理盐水组(C组)，每组24只，雌雄各半。A组以0.5% 84消毒液(常用消毒浓度)灌胃0.5 mL，B组以2.0% 84消毒液灌胃0.5 mL，C组以生理盐水灌胃0.5 mL，每天灌胃1次，连续灌胃9周。

1.3.2 一般状态观察 实验期间，每日观察各组动物的摄食、饮水量、活动及毛色等状况，每周称量体重1次，连续称量9周。

1.3.3 动情周期观察：从第2周开始，连续8周，A、B和C组各随机选取10只雌性小鼠，每天清晨采用阴道冲洗法做阴道脱落细胞涂片，光学显微镜下观察脱落细胞形态，以了解动情周期变化情况。判断标准参见教材[2]。

1.3.4 精子畸形率观察：第9周结束时，A、B和C组各随机选取6只雄性小鼠，取双侧附睾，置于生理盐水中，分离包膜，剪碎附睾，过滤后将滤液以1000 r/min离心2 min，弃上清液后制成悬液涂片，甲醇固定15 min，0.5%伊红染色1 min，置于玻片架上晾干，高倍镜下观察精子形态，每只动物观察精子1000个，计算精子畸形率[3]。

1.3.5 性激素和生化指标测定：第9周结束时，A、B和C组各随机选取12只，雌雄各半，眼球取血，分离血清，-20℃冰箱保存，严格按照试剂盒说明书进行操作，分别测定雄性小鼠的睾酮水平和雌性小鼠雌二醇水平。剩余血清采用全自动生化分析仪对血清进行生化分析。

1.3.6 组织切片：眼球取血后即刻颈椎脱臼法处死动物，解剖切取心、肝、肺、肾、睾丸(或卵巢)，4%多聚甲醛固定。固定好的标本用梯度浓度的乙醇脱水，正丁醇透明，石蜡包埋，切片厚5 μm，HE染色。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

经观察，各组小鼠外观、活动、饮水和摄食量均未见异常，与生理盐水组(C组)比较，0.5% 84消毒液组(A组)和2.0% 84消毒液组(B组)小鼠体重无显著性差异(P> 0.05)(表1)。

2.2 动情周期

小鼠动情周期一般为4～5 d，与C组比较，A组和B组小鼠雌性小鼠动情周期均较为规律，无显著性差异(P>0.05)(表2)。

2.3 精子畸形率

观察到的精子畸形率包括香蕉形、无钩、胖头、无定形、双头等。与C组比较，A组小鼠精子畸形率差异无显著性(P> 0.05)，B组小鼠精子畸形率显著增高(P=0.041<0.05)(表3)。

2.4 性激素测定

与C组比较，A组和B组小鼠雄性小鼠的睾酮水平和雌性小鼠的雌二醇水平差异无显著性(P>0.05)(表4和表5)。

表1 雌性和雄性小鼠体重变化(g)

表2 雌性小鼠动情周期

表3 雄性小鼠精子畸形率

表4 雄性小鼠血清睾酮水平

2.5 生化指标

与C组比较，A组和B组小鼠丙氨酸转氨酶、白蛋白、总蛋白、血尿素氮、肌酐、血糖、甘油三酯、胆固醇差异无显著性(P>0.05)(表6)。

2.6 组织切片

A、B组与C组心、脑、肝、脾、肺、肾、睾丸(或卵巢)组织切片均未发现异常。彩插6图1、2分别为三组卵巢、睾丸组织切片图。

表5 雌性小鼠血清雌二醇水平

3 讨论

IVC系统已被广泛应用，而浸泡消毒是最常用的IVC笼具消毒方式，浸泡消毒后的笼盒自然会有消毒液残留，实验动物饲养在笼盒内，其残留量是否对实验动物产生影响早就引起实验动物学界的关注[1,4]。同时，为了维护和保障实验动物伦理福利，充分体现“不伤害原则”[5]，我们也应了解消毒液残留量是否对实验动物产生影响。

表6 血清生化指标

84消毒液具有广谱、高效、快速的消毒杀菌作用，是浸泡IVC笼具的常用消毒液之一。李启富等[1]研究表明，0.5% 84消毒液浸泡10 min，效果很好，一年多未见污染，裸小鼠质量检测可达SPF级。本研究采用0.5%(常用消毒浓度)、2.0% 84消毒液分别对KM小鼠进行灌胃，对照组采用生理盐水进行灌胃，对实验小鼠的部分生殖生理相关指标进行了观察：与生理盐水组比较，0.5% 84消毒液组和2.0% 84消毒液组小鼠体重变化无显著性差异，雌性小鼠的动情周期差异无显著性，雄性小鼠血清睾酮和雌性小鼠雌二醇水平差异无显著性，部分生化指标检测无显著性差异。三组小鼠的心、肝、肺、肾和睾丸(或卵巢)组织切片均未发现异常。与生理盐水组比较，0.5% 84消毒液组小鼠精子畸形率差异无显著性，但是2.0% 84消毒液组小鼠精子畸形率差异有显著性(P=0.041<0.05)，提示此浓度的消毒液可能对小鼠的精子形成有影响，对于是否因此对小鼠繁殖性能有影响以及是否对仔鼠生长发育是否有影响还有待于进一步研究。

以上研究结果表明，0.5% 84消毒液对小鼠的生殖生理无明显影响，2.0% 84消毒液组小鼠精子畸形率显著增高，在实际使用中一定要严格控制消毒液浓度。下一步我们将对于低浓度消毒液对小鼠繁殖性能是否有影响以及是否对仔鼠生长发育有影响做进一步研究。

参考文献：

[1] 李启富，田泽敏，龚廷，等. IVC笼盒消毒灭菌效果的观察[J]. 中国比较医学杂志，2006，16(12)：757-759.

[2] 吴端生，张健. 现代实验动物学技术[M]. 北京：化学工业出版社，2007年：46.

[3] 汤百争，周正适，周智君. 低浓度臭氧对小鼠生殖生理的影响[J]. 中国比较医学杂志，2005，15(1)：32-34.

[4] 顾锋，王国强，沈志明，等. 独立通气笼合过氧乙酸灭菌效果初探[J]. 上海实验动物科学, 2003 , 23(2)：111- 113.

[5] 贺争鸣，李根平，李冠民，等.实验动物福利与动物实验科学[M]. 北京：科学出版社，2011年：47-49.