AT1受体自身抗体对糖尿病肾病大鼠肾脏细胞凋亡及JNK表达的作用*

徐春艳， 赵林双

(广州军区武汉总医院内分泌科，湖北 武汉 430070)

血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody，AT1-AA)属于G蛋白偶联受体家族，是针对AT1受体(AT1receptor，AT1R)的特异性抗体，具有类似血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)的生物学效应。自AT1-AA首次在先兆子痫患者体内被发现[1]以来，又先后证实其与难治性高血压患者蛋白尿发生率有关[2]，并参与了原发性肾小球疾病过程[3]，成为独立于高血压之外的致肾脏损害的因素。本课题组前期研究发现，糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)患者血清AT1-AA阳性率明显高于糖尿病患者和正常对照者[4]，提示AT1-AA与DN发病过程有关，但其致DN肾脏损害的具体机制尚不清楚。

研究显示，DN时肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)的活化可引起肾脏内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，并可通过JNK凋亡途径诱导肾脏细胞凋亡[5-6]。AT1R是RAS的关键因子，也是AT1-AA发挥效应的特异性受体，但其能否介导AT1-AA而致DN肾脏ERS反应，目前未见报道。因此，我们通过本研究探讨DN大鼠血清AT1-AA与肾脏ERS及其相关的JNK凋亡信号通路的关系，以进一步了解AT1-AA致DN肾脏细胞凋亡的分子机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物

36只4周龄雄性SD大鼠，购自武汉大学动物实验中心，实验动物合格证编号为42000500001559。饲养环境：室温20～24 ℃，相对湿度40%～60%，自由摄食饮水，12 h交替照明。

2 主要试剂和仪器

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma)；TUNEL试剂盒(Promega)；BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78， GRP78)抗体(Bioworld);磷酸化c-Jun N末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)抗体(Santa Cruz)；β-actin抗体、羊抗小鼠Ⅱ抗、羊抗兔Ⅱ抗和兔抗小鼠Ⅱ抗(武汉博士德生物工程有限公司)。全自动生化仪(BECKMAN COULTER UniCelDxC 800)；HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统(广州军区武汉总医院医学实验科提供)。

3 主要方法

3.1模型大鼠的建立 所有大鼠适应性喂养1周后随机选取6只为正常对照(NC)，选取30只进行造模处理。NC组大鼠以普通饲料食喂养，造模大鼠以高糖高脂饲料喂养。造模大鼠于高糖高脂喂养4周时腹腔注射1%的STZ溶液(35 mg/kg)，NC组注射等量的柠檬酸缓冲液。72 h后测尾静脉血糖，随机血糖>16.7 mmol/L认为糖尿病大鼠模型建立成功，继续高糖高脂喂养，每周复测血糖，持续观察12周至其自然进展至DN阶段[7]。 将模型建立成功大鼠统一归为模型组(model组)。

3.2血清AT1-AA的测定及分组 大鼠称重，给予10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔麻醉，腔静脉取血，收集血清，分装后-20 ℃保存。AT1R抗原肽片段的氨基酸序列为5’-IHRNVFFIENTTNITVCAFHYESQNSTL-3'(由华中科技大学附属协和医院心血管研究室人工合成并馈赠)。ELISA法测定血清AT1-AA 的A值[8]，根据AT1-AA测定结果，随机选择DN大鼠纳入DN组，并分AT1-AA阳性DN(AT1-AA positive DN，APD)和AT1-AA阴性DN(AT1-AA negative DN，AND)亚组。

3.3血、尿生化指标的检测 实验结束前1 d，用代谢笼收集大鼠24 h尿液并记录尿量，4 ℃保存。应用全自动生化仪检测尿肌酐(urine creatinine，UCr)和尿微量白表达(urine microalbumin，UMA)；同时检测血糖(blood glucose，BG)、血肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，计算肌酐清除率(creatinine clearance rate，CCr)。

3.4TUNEL染色测定肾脏细胞凋亡 制备肾组织石蜡切片，常规脱水，严格按试剂盒说明进行TUNEL染色，DAB显色。光镜下观察，凋亡细胞呈棕褐色。应用MIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统计数凋亡细胞，计算凋亡率。

3.5Western blotting技术测定肾组织GRP78和p-JNK蛋白表达 提取大鼠肾组织总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。10%的SDS-PAGE分离蛋白，PVDF膜印迹，5%脱脂奶粉封闭，GRP78抗体(1∶600)、p-JNK抗体(1∶3 000)或β-actin抗体(1∶400)浸泡，4 ℃过夜,分别加入辣根过氧化物酶HRP标记的Ⅱ抗(1∶50 000)孵育2 h,滴加ECL底物液，暗视中X光片压片、显影、定影，应用凝胶成像系统分析胶片灰度值比值，进行蛋白的定量分析。

4 统计学处理

数据采用SPSS 19.0软件进行分析。计数资料以构成比表示，采用2检验；计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Model组和NC组大鼠一般情况比较

实验结束时，造模大鼠5只死亡，1只未成模，成模率为96.7%，死亡率为16.7%。与NC组大鼠比较，model组大鼠体重明显减轻，而血糖及肾脏肥大指数均明显升高，见表1。

表1 NC组和model组大鼠血糖、体重和肾肥大指数的比较

2 大鼠血清AT1-AA阳性率结果及亚组分组

Model组大鼠血清AT1-AA阳性率为62.5%，较NC组16.7%明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。根据AT1-AA结果，在24只Model组大鼠中随机选取8只AT1-AA阳性和4只AT1-AA阴性大鼠纳入DN组，其中AT1-AA阳性DN为APD亚组，AT1-AA阴性DN为AND亚组。

3 APD和AND亚组大鼠肾功能生化指标结果比较

与NC组比较，APD亚组大鼠的BUN和24 h UMA水平明显升高(均P<0.01)，CCr显著降低(P<0.05)；与APD亚组大鼠比较，前述各生化指标在AND亚组大鼠中变化程度相对较轻，见表2。

表2 各亚组大鼠肾功能生化指标结果比较

4 AT1-AA对DN组大鼠肾脏细胞凋亡的影响

DN组大鼠肾脏细胞凋亡率(16.65±5.01)较NC组大鼠(0.38±0.24)显著增高(P<0.01)，其中肾小管上皮细胞和肾小球足细胞均有凋亡，但以肾小管上皮细胞凋亡为主。进一步观察发现，APD亚组大鼠肾脏细胞凋亡率(20.05±1.71)明显高于AND亚组(13.24±4.93)(P<0.01)，见图1。

Figure 1. Apoptosis of renal cells in all groups under optical microscope by TUNEL staining assay (×400). Apoptotic cells were brown as indicated by the arrows. Mean±SD. n=4～12. ** P<0.01 vs NC group; ##P<0.01 vs AND sub-group.

5 DN组和NC组大鼠肾组织GRP78及p-JNK蛋白表达比较

Western blotting结果显示，DN组大鼠肾组织GRP78和p-JNK的表达分别为0.750±0.030和0.603±0.048，而NC组大鼠为0.334±0.001和0.209±0.003，2组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

Figure 2. The protein levels of GRP78 and p-JNK in DN group and NC group. Mean±SD. n=6～12.**P<0.01 vs NC group.

6 APD和AND亚组大鼠肾组织GRP78及p-JNK蛋白表达比较

进一步研究发现，APD亚组GRP78的表达(0.774±0.026)较AND亚组(0.728±0.003)明显升高(P<0.05)；且APD亚组p-JNK的表达(0.643±0.026)亦高于AND亚组(0.562±0.018)(P<0.01)，见图3。

Figure 3. The protein levels of GRP78 and p-JNK in APD and AND sub-groups. Mean±SD. n=4～8. #P<0.05, ##P<0.01 vs AND sub-group.

讨 论

DN是糖尿病危险而严重的微血管并发症，其发病率呈逐年上升趋势，已成为人类健康的重要威胁。但因DN是多因素综合作用的结果，发病机制十分复杂，至今仍未完全明确。本课题组前期大量临床研究发现，G蛋白偶联受体自身抗体相关的自身免疫反应参与了DN的发病过程，并与DN患者蛋白尿水平关系密切[9]，因而认为自身免疫机制在DN病程中也起了重要作用。其中，AT1-AA通过与RAS的关键因子AT1R胞外第二环肽上的氨基酸序列特异性结合而发挥AngⅡ样激动效应，且该激动效应不随时间而脱敏。目前普遍认为，各种组织损伤和生理紊乱所致隐蔽抗原暴露，机体自身免疫应答反应激活，均可使机体AT1-AA产生增多[10]。而在DN状态下，高糖毒性和RAS活化等因素可能通过循环或局部组织AngⅡ浓度升高或胞内信号通路变化而致AT1R的构象和密度改变，进而引起血清AT1-AA生成增多，但AT1-AA与DN肾脏结构损害的关系及作用机制，目前未见报道。

肾脏细胞凋亡在DN肾功能恶化过程中起重要作用，是DN肾损害的重要机制。本研究采用高糖高脂饮食联合小剂量STZ腹腔注射，然后继续高糖高脂喂养，任糖尿病大鼠自然进展为DN阶段而得到的DN模型，是目前公认的接近人类2型DN自然病程和代谢特点的大鼠模型。实验中，TUNEL染色检测DN大鼠肾脏细胞凋亡并定位发现，AT1-AA阳性DN大鼠肾脏细胞凋亡率明显高于AT1-AA阴性DN大鼠，表明AT1-AA在DN大鼠肾脏细胞凋亡过程中起到一定作用。大量肾脏细胞凋亡可直接导致尿蛋白水平显著增加，肾功能明显降低，这是本研究中AT1-AA阳性和阴性DN大鼠肾功能生化指标差异显著的原因，但AT1-AA致肾脏细胞凋亡的具体分子机制还需进一步探索。

内质网是蛋白质合成、加工和Ca2+储存及信号转导的重要场所，可通过ERS对各种因素所致的应激反应起调节作用[11]。早期ERS能激活未折叠蛋白反应，减少蛋白质合成，增加蛋白质折/叠降解来维持细胞内环境的稳定，在该反应过程中，内质网中的分子伴侣GRP78起着主要的调控作用而成为ERS的标志性蛋白[12]。然而过度ERS会通过其相关的3条凋亡途径：CHOP/GADD153基因激活转录，JNK磷酸化和caspase-12活化，促进应激受损细胞的凋亡[13]。其中，JNK是丝裂原活化蛋白激酶家族的重要成员，可在各种应激刺激(如高糖，氧化应激，G蛋白偶联受体激活等)作用下磷酸化而活化。p-JNK主要通过调控转录因子c-Jun的活性，上调促凋亡蛋白Bim、Bax等的表达引起细胞凋亡[14]。

研究发现，DN大鼠肾脏ERS反应与肾小管细胞的凋亡有关[15]，且高糖可激活足细胞内ERS相关的多条凋亡途径，引起足细胞的损伤和凋亡[16]，均表明过度ERS在DN肾脏细胞凋亡过程中起着重要作用。研究证实，AngⅡ能上调心肌细胞GRP78的表达，并介导心肌细胞的凋亡，而AT1R特异性拮抗剂可降低DN大鼠肾组织GRP78及p-JNK蛋白的表达，抑制JNK途径介导的肾脏细胞凋亡[6]。已知AT1-AA与AngⅡ均可通过AT1R而激活下游信号分子，并能经相似的信号通路发挥效应，故假设DN发电时，血清中持续存在的高滴度AT1-AA通过AT1R激活肾脏ERS反应，并活化JNK凋亡信号通路，使p-JNK凋亡蛋白的水平增高，促进肾脏细胞凋亡。但关于血清AT1-AA与肾脏ERS反应的研究，目前尚少。

本实验中，我们利用Western blotting技术对DN组和NC组大鼠肾脏GRP78和p-JNK蛋白进行定量分析。结果显示，DN组大鼠前述蛋白水平较NC组大鼠显著升高，提示DN组大鼠肾脏发生了ERS反应，并激活了ERS相关的凋亡信号通路，与国内外的报道一致。为明确AT1-AA对DN大鼠肾脏ERS的影响，我们进一步研究了AT1-AA阳性和阴性亚组DN大鼠的Western blotting结果，发现AT1-AA阳性DN大鼠ERS标志蛋白GRP78和凋亡蛋白p-JNK的表达均不同程度高于AT1-AA阴性DN大鼠。据此我们认为，DN大鼠血清AT1-AA与肾脏ERS关系密切，AT1-AA可调控ERS标志蛋白GRP78的转录，且持续存在的AT1-AA的病理性刺激，又能激活ERS相关的JNK凋亡通路；与AT1-AA阴性DN大鼠比较，AT1-AA阳性大鼠肾组织p-JNK蛋白表达上调，肾脏细胞凋亡增加，也说明AT1-AA能通过ERS的JNK凋亡途径促进肾脏细胞凋亡，证实了我们的假设。

综上所述，血清AT1-AA的肾脏损害作用与其所致的肾脏细胞凋亡有关；AT1-AA可诱导DN大鼠肾脏ERS反应，并上调p-JNK凋亡蛋白的表达，通过JNK通路促进肾脏细胞凋亡。这些研究结果可为进一步完善DN的免疫机制及通过干扰ERS中的自身免疫环节来防治DN提供全新的理论支持。

[参 考 文 献]

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