淮山组织培养抑制褐变的研究

潘梅+王景飞+黄赛+吕德任+戚华莎+符瑞侃

摘要：以淮山品种桂淮5号为供试材料，研究不同外植体、培养条件、培养基质以及抗褐化剂等对淮山褐变的影响。结果表明，茎段外植体的褐变程度较轻，薯块外植体的褐变程度严重；温度和光照对褐变均有影响；液体培养的褐变程度较固体培养轻；在培养基中添加1.0 g/L活性炭，能够有效抑制外植体的褐化，使褐化率降为70.37%，培养物能正常生长发育。

关键词：淮山；组织培养；褐变；外植体；抗褐化剂

中图分类号： Q943.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0057-03

收稿日期：2013-09-14

基金项目：海南省农业科技示范推广项目（编号：琼农计财[2012]48号）；海南省农业综合开发项目（编号：琼农办[2012]825）。

作者简介：潘梅（1962—），女，广西隆安人，高级园艺师，主要从事植物组织培养与开发利用研究。E-mail：panmei200@sina.com。

通信作者：符瑞侃，园艺师，主要从事药用植物资源开发与利用研究。E-mail：fu0898@163.com。淮山（Dioscorea opposita）为薯蓣科薯蓣属多年生草本植物，其块根含有大量的蛋白质、淀粉、维生素和有益的微量元素，目前已成为重要的国际性药食兼用作物和珍稀蔬菜，市场需求量极大。在生产上，淮山主要利用薯块和零余子制种繁殖，病虫害较多，而且种性较易退化，产量和品质难以保障。运用组织培养技术是繁育淮山良种最为有效的方法，不仅能够解决淮山繁殖系数低及长期营养繁殖所造成的病毒病和品质退化等问题，也是实现淮山产业化生产的基础。已有学者开展了淮山组织培养研究[1-10]，但在淮山组织培养中褐化现象特别严重，影响培养物的生长发育，增殖率低，甚至导致培养物死亡。褐化现象是影响淮山组织培养的一个关键因素，目前有关淮山组织培养快速繁殖中的褐化问题研究很少[11]。因此，本研究探讨了淮山外植体类型、培养条件、培养基质以及抗褐化剂类型等对淮山组织培养过程中外植体褐化的影响，以期为淮山组织培养快速繁殖提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

试验材料为淮山品种桂淮5号的薯块及薯块催生的幼嫩茎段。

1.2试验方法

1.2.1外植体预处理切取薯块和带节茎段，在洗衣粉液中浸泡10 min后用流水冲洗干净，在超净工作台上用75%乙醇表面消毒30 s，以无菌水冲冼2次后用0.1% HgCl2浸泡薯块25 min、茎段8 min，最后用无菌水冲洗5次，薯块切成约1 cm见方的小块，茎段切成长约2 cm的带节小段，接种到培养基中。

1.2.2培养基以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 g/L NAA作为基础培养基，所有培养基均含有30 g/L食用白糖，固体培养基添加6 g/L卡拉胶，pH值5.8。分装好的培养基均经121 ℃、0.14 MPa高温高压灭菌20 min。

1.2.3试验设计（1）以薯块和茎段2种类型的外植体进行接种试验，研究不同外植体类型的褐化反应；（2）设置22、25、28、32 ℃ 4种温度，研究不同温度对外植体褐化的影响；（3）设置0、500、1 000、1 500、2 000、2 500 lx 6种光照强度，研究不同光照强度对外植体褐化的影响；（4）培养基中添加 200 mg/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、300 mg/L聚乙烯吡咯烷酮、200 mg/L半胱氨酸、200 mg/L抗坏血酸、1.0 g/L活性炭，研究不同抗褐化剂对外植体褐化的影响；（5）设置添加6 g/L卡拉胶的固体培养基和未加卡拉胶的液体培养基（摇床转速为100 r/min）进行外植体接种，观察培养过程中的褐化情况，研究不同培养基质对外植体褐化的影响。

试验项（1）～（4）采用10 cm×10 cm的聚丙烯透明薄膜袋作为培养容器，试验项（5）以直径6 cm、高9 cm的玻璃瓶为培养容器，所有处理均接种60袋（瓶），每袋（瓶）1个外植体，分别在接种后的10、20、30 d观察外植体的褐化情况和生长情况，所有数据均为培养30 d的结果。

1.2.4培养条件无特别说明，培养温度均为25 ℃，光照强度为1 500 lx，光照时间为8 h/d。

1.2.5统计方法依据培养袋中培养基的褐化直径将褐化程度分为4个等级：（1）无褐化。培养基中未出现褐色。（2）轻度褐化。培养基褐色直径<2 cm。（3）中度褐化。培养基褐色直径2～5 cm。（4）重度褐化。培养基褐色直径>5 cm，外植体枯死（图1-A ）。

褐化率=褐化外植体数/（接种外植体总数-被污染的外植体数）×100%；各级褐化率=各级褐化数/（接种外植体总数-被污染的外植体数）×100%；中度及以上褐化率=中度褐化率+重度褐化率。

2结果与分析

2.1淮山不同外植体的褐化反应

2种外植体接种后3 d后均开始出现褐化现象，培养30 d所有外植体基部培养基均出现不同程度的褐化。由表1可知，2种外植体褐化程度不同，茎段外植体的褐化程度相对较

褐化率（%）茎段07.8429.4162.7592.16薯块02.046.1291.8497.96

轻，轻度和中度褐化率合计为37.25%，重度褐化率为6275%；而薯块外植体的褐化现象严重，培养基大面积出现黑褐色，轻度、中度褐化率合计仅占8.16%，而重度褐化率高达91.84%，比茎段外植体高出29.09百分点。这可能是因为薯块本身所含酚类物质较多，加之接种前切成块状，损伤面较大，损伤面细胞中的酚类物质与氧气聚合发生氧化反应，形成较多的有毒醌类物质扩散到培养基中[11]。

可以看出，随着培养温度升高，外植体褐化率加大，当温度达到28 ℃时，外植体全部出现褐化现象；褐化程度也随着温度升高而加重，表现为轻度褐化的比例逐渐减少，重度褐化的比例逐渐加大。当温度为22 ℃时，中度及以上褐化率最低，为80.70%，25、28 ℃时分别为89.09%、94.44%，而当温度达到32 ℃时，中度及以上褐化率最高，达到96.23%，可见温度对淮山褐化的影响较大。因为淮山的生长要求温暖气候，25～28 ℃为其最适宜温度范围[10]，所以培养室温度不宜过低。根据试验结果及淮山生长适宜温度要求，淮山组织培养的温度以25 ℃为宜。

不同培养温度对外植体褐化的影响

培养温度

（℃）无褐化率

（%）轻度褐化

率（%）中度褐化

率（%）重度褐化

率（%）中度及以上

褐化率（%）223.51 15.7928.0752.6380.70251.829.0918.1870.9189.092805.5622.2272.2294.443203.7716.9879.2596.23

2.3不同光照强度对外植体褐化的影响

由表3可见，外植体的褐化随着光照强度增强而加重，在0～1 000 lx光照强度下培养，少量外植体未出现褐化现象，褐化程度较轻，中度及以上褐化率为78.85%～88.89%；当光照强度在1 500、2 000 lx时，中度及以上褐化率相差不大，分别为92.85%、94.55%；当光照强度达到3 000 lx时，中度及以上褐化率达到100%。因此，综合考虑外植体的褐化情况以及生长所需的光照，淮山组织培养光照强度以1 500～2 000 lx 为宜。

表3不同光照强度对外植体褐化的影响

光照强度

（lx）无褐化率

（%）轻度褐化

率（%）中度褐化

率（%）重度褐化

率（%）中度及以上

褐化率（%）07.6913.4623.0855.7778.855005.5611.1016.6766.6783.341 0001.859.2618.5270.3788.891 50007.1523.2169.6492.852 00005.4523.6470.9194.553 0000024.5375.47100

2.4不同抗褐化剂对外植体褐化的影响

从表4可知，4种抗褐化剂均能不同程度地抑制外植体的褐化，中度及以上褐化率均低于对照处理。外植体在添加4种抗褐化剂的培养基中都能正常生长，月增殖倍数均大于对照处理。培养10～15 d，4种抗褐化剂的抑制效果较明显，但随着培养时间延长，各处理的褐化现象均越来越重，所有处理外植体基部培养基均有全部褐化的现象，只是数量不同。加入活性炭的处理对外植体褐化的抑制效果最好，外植体初始褐化时间为5 d，比其他4种抗褐化剂处理晚2 d，褐化率最低，为70.37%，而且褐化程度最轻，外植体基部培养基褐化直径小于2 cm的占51.85%，重度褐化率仅为185%，中度及以上褐化率为18.52%。PVP处理对外植体褐化的抑制效果居于第二，且高浓度PVP优于低浓度PVP。半胱氨酸和抗坏血酸2种处理对外植体褐化的抑制效果较差，中度及以上褐化率分别为86.45%、90.91%。因此，在培养基中添加活性炭对外植体褐化的抑制起到了良好的作用。

2.5不同培养基质对外植体褐化的影响

本试验中外植体褐化现象在2种基质中的

不同抗褐化剂对外植体褐化的影响

抗褐化剂无褐化

率（%）轻度褐

化率（%）中度褐

化率（%）重度褐

化率（%）中度及以上

褐化率（%）200 mg/L PVP3.7012.9627.7855.5683.34300 mg/L PVP5.3623.2130.3641.0771.43200 mg/L半胱氨酸5.088.4717.069.4586.45200 mg/L抗坏血酸1.827.2721.8169.1090.911 g/L活性炭29.6351.8516.671.8518.52对照06.6727.5065.8393.33

表现差别较大，固体培养基中褐化程度明显大于液体培养基，其初始褐化时间早，出现枯死株，抽生芽生长状况差。固体培养基中培养3 d开始出现褐化，培养10 d时，所有外植体基部的固体培养基均出现褐化现象，以外植体基部为中心，培养基褐化直径1～2 cm的占75.93%，3～4 cm的占24.07%；培养时间延至30 d时，72.22%的外植体基部培养基褐化直径达到了5 cm左右，组培苗茎节数少且较为细弱。液体培养方式培养8 d时培养液开始出现褐色，10 d后培养液变为浅褐色，培养时间达到30 d后，培养液变为深褐色，但外植体生长状况良好，分化芽苗多而粗壮，最多达到12芽，平均增殖倍数为5.11，比固体培养方式高2.24。可能是因为外植体溢出的有毒物质在液体中可以很快扩散而被稀释，短时间内无法形成一个有效作用浓度点，因而对外植体造成的伤害较轻。因此，液体培养方式比固体培养方式更适宜淮山的快速繁殖。

不同培养基质对外植体褐化的影响

培养基质初始褐化

时间（d）枯化株数

（株）增殖倍数生长状况固体培养基322.87较细弱液体培养基805.11粗壮

3结论与讨论

3.1不同外植体的褐化程度不同

本试验结果表明，茎段外植体的褐化程度较薯块外植体轻，该结果与蔡建荣的研究结果[11]一致。淮山的组织培养以茎段作为外植体较适宜。

3.2温度、光照对褐化均有影响

本试验中，随着培养温度升高和光照强度加强，外植体的褐化程度加重，温度为25 ℃，光照强度为1 500～2 000 lx时，外植体褐化较轻并能正常生长。淮山外植体低温和暗处理的褐化率最低，褐化程度最小，因为酚类化合物合成和氧化过程中有许多酶系统参与，而酶系统的活性受温度和光照影响。高温和光照会提高酶的活性，促进培养组织中酚类物质氧化，加速外植体褐化，因此在低温、黑暗或遮光条件下培养外植体可以降低多酚氧化酶的活性，减少酚类氧化，从而减轻褐化。外植体的生长发育需要适宜的温度和光照，应以能降低外植体褐化而又不影响其正常生长的范围为宜。

3.3不同抗褐化剂对褐化的影响差异大

本试验结果表明，培养基中添加1 g/L活性炭抑制褐化的效果最好，褐化率比对照下降近30%，且褐化程度多在中度以下，中度及以上褐化率仅为18.52%；300 mg/L PVP抑制褐化的效果次之，中度及以上褐化率为71.43%；而半胱氨酸和抗坏血酸抑制褐化效果不显著，中度及以上褐化率分别为86.45%、90.91%，这也许与添加的浓度较低有关。活性炭和PVP都是吸附剂，可以去除酚类氧化物造成的毒害效应，它们的主要作用在于通过氢键、范德华力等作用力把有毒物质从外植体周围吸附掉。活性炭除了有吸附作用外，在一定程度上还降低了光照强度，从两方面减轻了褐变[12]。本试验结果与蔡建荣的研究结果有所不同，蔡建荣认为PVP抑制褐化的效果优于活性碳[11]，该结果的差异可能与试验材料不同有关。

3.4液体基质较固体基质褐化轻

本试验结果表明，淮山组织培养的最适培养基质为不加卡拉胶的液体培养基，能有效预防褐化，提高成活率，培养物生长快且繁殖系数大，但由于液体培养需要特别的设备，并不适宜进行大规模的培养，只适宜前期的诱导培养和初始培养材料较少时使用，故淮山的组培育苗仍应以固体培养基质为主。

3.5淮山的褐化现象难以完全抑制

本研究结果表明，在淮山的组织培养过程中，培养物的褐化现象不能完全控制，单因素措施在一定程度上可以控制淮山的褐化程度，采用综合措施在培养基中添加抗褐化剂以及调控培养条件能更有效地降低培养物的褐化率和褐化程度，不影响组织的生长和芽的分化，使培养物能正常生长发育。

参考文献：

[1]李明军. 怀山药茎段愈伤组织的诱导与多芽体的形成[J]. 华北农学报，2000，15（2）：85-88.

[2]蔡建荣，曾军，张志勇，等. 怀山药茎段组织培养及增殖的研究[J]. 福建农业科技，2002（2）：14-15.

[3]王红娟，王天亮，白自伟，等. 激素配比对怀山药不同外植体诱导不定芽的影响[J]. 河南农业科学，2006（12）：73-74.

[4]薛建平，赵小全，张爱民，等. 正交试验在怀山药组织培养中的应用[J]. 中国中药杂志，2008，33（16）：1952-1955.

[5]彭琴，陈晔，樊有赋. 瑞昌山药茎段组织培养研究[J]. 长江蔬菜，2009（10）：10-12.

[6]严华兵，龚明霞，董伟清，等. 山薯组培苗继代培养基配方筛选[J]. 广西农业科学，2010，41（8）：758-761.

[7]唐君，赵冬兰，张允刚. NAA和几种细胞分裂素对怀山药离体快繁的影响[J]. 中国农学通报，2005，21（12）：83-85.

[8]蔡建荣.山药茎节间部组织培养及移栽技术研究[J]. 江西农业学报，2006，18（4）：108-109.

[9]段延碧，郭华春. 山药（Dioscorea opposite）组织培养的初步研究[J]. 云南农业学报，2006，19（增刊）：59-62.

[10]丰锋，叶春海，王耀辉，等. 淮山的组织培养与快速繁殖[J]. 仲恺农业技术学院学报，2007，20（1）：24-28，32.

[11]蔡建荣. 山药组织培养褐化反应的研究[J]. 中国农学通报，2008，24（8）：118-120.

[12]程广有. 名优花卉组织培养技术[M]

3.3不同抗褐化剂对褐化的影响差异大

本试验结果表明，培养基中添加1 g/L活性炭抑制褐化的效果最好，褐化率比对照下降近30%，且褐化程度多在中度以下，中度及以上褐化率仅为18.52%；300 mg/L PVP抑制褐化的效果次之，中度及以上褐化率为71.43%；而半胱氨酸和抗坏血酸抑制褐化效果不显著，中度及以上褐化率分别为86.45%、90.91%，这也许与添加的浓度较低有关。活性炭和PVP都是吸附剂，可以去除酚类氧化物造成的毒害效应，它们的主要作用在于通过氢键、范德华力等作用力把有毒物质从外植体周围吸附掉。活性炭除了有吸附作用外，在一定程度上还降低了光照强度，从两方面减轻了褐变[12]。本试验结果与蔡建荣的研究结果有所不同，蔡建荣认为PVP抑制褐化的效果优于活性碳[11]，该结果的差异可能与试验材料不同有关。

3.4液体基质较固体基质褐化轻

本试验结果表明，淮山组织培养的最适培养基质为不加卡拉胶的液体培养基，能有效预防褐化，提高成活率，培养物生长快且繁殖系数大，但由于液体培养需要特别的设备，并不适宜进行大规模的培养，只适宜前期的诱导培养和初始培养材料较少时使用，故淮山的组培育苗仍应以固体培养基质为主。

3.5淮山的褐化现象难以完全抑制

本研究结果表明，在淮山的组织培养过程中，培养物的褐化现象不能完全控制，单因素措施在一定程度上可以控制淮山的褐化程度，采用综合措施在培养基中添加抗褐化剂以及调控培养条件能更有效地降低培养物的褐化率和褐化程度，不影响组织的生长和芽的分化，使培养物能正常生长发育。

参考文献：

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[11]蔡建荣. 山药组织培养褐化反应的研究[J]. 中国农学通报，2008，24（8）：118-120.

[12]程广有. 名优花卉组织培养技术[M]

3.3不同抗褐化剂对褐化的影响差异大

本试验结果表明，培养基中添加1 g/L活性炭抑制褐化的效果最好，褐化率比对照下降近30%，且褐化程度多在中度以下，中度及以上褐化率仅为18.52%；300 mg/L PVP抑制褐化的效果次之，中度及以上褐化率为71.43%；而半胱氨酸和抗坏血酸抑制褐化效果不显著，中度及以上褐化率分别为86.45%、90.91%，这也许与添加的浓度较低有关。活性炭和PVP都是吸附剂，可以去除酚类氧化物造成的毒害效应，它们的主要作用在于通过氢键、范德华力等作用力把有毒物质从外植体周围吸附掉。活性炭除了有吸附作用外，在一定程度上还降低了光照强度，从两方面减轻了褐变[12]。本试验结果与蔡建荣的研究结果有所不同，蔡建荣认为PVP抑制褐化的效果优于活性碳[11]，该结果的差异可能与试验材料不同有关。

3.4液体基质较固体基质褐化轻

本试验结果表明，淮山组织培养的最适培养基质为不加卡拉胶的液体培养基，能有效预防褐化，提高成活率，培养物生长快且繁殖系数大，但由于液体培养需要特别的设备，并不适宜进行大规模的培养，只适宜前期的诱导培养和初始培养材料较少时使用，故淮山的组培育苗仍应以固体培养基质为主。

3.5淮山的褐化现象难以完全抑制

本研究结果表明，在淮山的组织培养过程中，培养物的褐化现象不能完全控制，单因素措施在一定程度上可以控制淮山的褐化程度，采用综合措施在培养基中添加抗褐化剂以及调控培养条件能更有效地降低培养物的褐化率和褐化程度，不影响组织的生长和芽的分化，使培养物能正常生长发育。

参考文献：

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[5]彭琴，陈晔，樊有赋. 瑞昌山药茎段组织培养研究[J]. 长江蔬菜，2009（10）：10-12.

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