氧化应激对多囊卵巢综合征患者体外受精-胚胎移植结局的影响

刘忠慧，黄鑫，郝翠芳＊

（1.青岛大学，青岛 266071；2.山东烟台毓璜顶医院生殖医学科，烟台 264000）

多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄女性最常见的内分泌紊乱性疾病［1］，发病率约为5%～10%［2］。有研究称，根据鹿特丹标准诊断出的PCOS，其发病率可达18%［3-4］。现今在全球范围内PCOS发病率呈逐年升高趋势，其复杂的生理及代谢改变可影响女性一生的健康［3］，但病因及发病机制至今未明［5］。PCOS是导致育龄期女性月经紊乱和无排卵型不孕的主要原因［6］。并有研究指出，约90%的PCOS女性伴不孕［4］。因此关于PCOS发病机制的研究不仅是国内外妇科内分泌学研究的热点，也是辅助生殖技术（ART）研究的重点。越来越多的证据表明，胰岛素抵抗、低度慢性炎症及氧化应激（OS）与PCOS的发生发展有直接的关系［7-9］。

卵泡液提供卵母细胞发育的微环境［5］。众所周知，PCOS患者存在卵母细胞成熟障碍。同时有研究显示，OS与卵母细胞成熟度、胚胎发育潜能有直接的关系［10］。本研究比较接受体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的PCOS患者和非PCOS患者卵泡液中OS相关指标的水平及其与IVF 结局参数的关系，以期揭示OS对PCOS患者IVF结局的影响。

材料和方法

一、研究对象

患者均来源于2013年7月至2014年3月在烟台毓璜顶医院行IVF-ET 者。PCOS 组25 例，PCOS的诊断标准参照2003年欧洲人类生殖和胚胎学会／美国生殖医学会（ESHRE／ASRM）制订的鹿特丹标准［11-13］，符合以下三项标准中的两项者即可诊断：（1）稀发排卵或无排卵；（2）超声显示为卵巢多囊样改变（至少一侧卵巢可见12个及以上且直径为2～8mm 的卵泡和（或）卵巢体积＞10ml）；（3）有高雄激素的临床和（或）生物化学征象，排除先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征、分泌雄激素的卵巢和肾上腺肿瘤。对照组23 例非PCOS患者，入选标准为继发性不孕，因输卵管因素于我院行IVF 治疗的患者，并排除患有其他内分泌疾病，如糖尿病、高血压、甲状腺功能亢进、甲状腺功能低下及子宫内膜异位症等影响妊娠的疾病。该研究经烟台毓璜顶医院伦理委员会批准，受试者均签署相关的知情同意书。

（J Reprod Med2014，23（12）：976-980）

二、方法

1.卵泡液收集：取卵日超声引导下首先穿刺位置最低的直径在18～22mm 的一个大卵泡，穿刺时穿刺针尽量避开血管，适当负压抽吸，单独将该管无血染的卵泡液送入胚胎实验室，单独放置并进行标注姓名、日期等相关信息，实验室在解剖镜下寻找卵母细胞，完成找卵后，立即将卵泡液于2 500r／min下离心20min，将清亮无血染的上清液用移液器分装于Eppendorf管中，立即-80℃冷冻保存，批量检测，并避免反复冻融，保证测定的可靠性。

2.样本检测：卵泡液中超氧化物歧化酶（SOD）活力测定，试剂盒购自美国BioVision公司，采用化学发光法，测定步骤严格按照试剂盒说明书进行。卵泡液抑制羟自由基（·OH，活性氧中最活跃的一种）产生的能力测定及丙二醛（MDA）测定，采用南京建成生物公司试剂盒，分别利用Fenton反应、硫代巴比妥酸法进行测定。卵泡液中总抗氧化能力（TAC）测定采用化学发光法，试剂盒购自南京建成生物公司。其余指标如晚期氧化蛋白产物（AOPP）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、还原型谷胱甘肽（GSH）、辅酶Q10的测定采用酶联免疫吸附试验（ELISA），试剂盒购自上海义森生物科技公司。

3.临床资料及检测指标：采集患者年龄、基础内分泌、测量身高、体重并计算体质量指数（BMI）等资料。于月经第2～3 天测定血清卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、睾酮（T）水平。

三、统计学处理

采用SPSS16.0统计软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差的形式描述，两组间各项指标比较首先采用方差齐性检验和正态性检验，若方差齐则用两独立样本t检验，方差不齐则采用校正t检验，非正态分布的指标采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者临床特征及性激素水平比较

研究对象的一般临床特征及性激素水平。PCOS组基础E2、T、LH、LH／FSH 水平均高于对照组，两组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），而对照组基础FSH 水平高于PCOS 组（P＜0.05）。除此之外，两组患者其他指标均无统计学差异（P＞0.05）（表1）。

二、两组获卵数、受精率、优胚率比较

研究对象的获卵数、成熟卵率（MⅡ卵数／获卵数）、受精率（受精的卵数／获卵数）、优胚率（优质胚胎数／受精卵数）比较。PCOS 组有较高的获卵数，与对照组比较差异有统计学意义（P＝0.006），卵母细胞成熟率、受精率及IVF优胚率两组间无显著性差异（P＞0.05）（表2）。

三、两组取卵日卵泡液中相关氧化应激指标的比较

代表氧化状态的指标：晚期AOPP、脂质MDA、GSSG；表示抗氧化或还原状态的指标：TAC、经典的酶类抗氧化物超氧化物歧化酶（SOD）、卵泡液抑制·OH 产生的能力、抗氧化辅酶Q10（CoQ10）、GSH；代表卵泡液中的总体氧化／抗氧化平衡状态的GSH／GSSG。结果显示，与对照组相比，PCOS 组GSH／GSSG 较低，差异有统计学意义（P＝0.036）（表3）。

表1 PCOS组和对照组基本临床资料比较（±s）

表1 PCOS组和对照组基本临床资料比较（±s）

注：与对照组比较，＊P＜0.05

组 别 例数 年龄（岁）BMI（kg／m2）基础FSH（U／L）基础LH（U／L） LH／FSH 基础T（nmol／L）基础E2（pmol／L）7 0.77±0.24 0.79±0.25 119.17±45.90 PCOS组 25 30.68±2.73 24.14±3.03 5.24±1.14＊ 9.21±5.44＊ 1.74±0.80＊ 1.47±0.64＊ 149.14±49.12对照组 23 31.78±3.62 23.08±3.07 6.38±1.53 4.83±1.7＊

表2 PCOS组和对照组IVF结局指标的比较（±s）

表2 PCOS组和对照组IVF结局指标的比较（±s）

注：与对照组比较，＊P＜0.05

组 别 例数 获卵数（个） 成熟卵率（%） 受精率（%） 优胚率（%）23 12.78±5.92 0.71±0.20 0.78±0.18 0.51±0.16 PCOS组 25 17.56±5.58＊对照组0.75±0.15 0.78±0.17 0.57±0.23

表3 PCOS组和对照组氧化应激相关指标比较（±s）

表3 PCOS组和对照组氧化应激相关指标比较（±s）

注：与对照组比较，＊P＜0.05

组 别 例数 MDA（nmol／L） 抑制·OH（U／L） AOPP（μmol／L） GSSG（nmol／L）对照组 23 2.30±1.13 0.15±0.01 148.62±7.40 0.07±0.1 0 PCOS组 25 2.99±0.67 0.15±0.01 141.65±9.70 0.08±0.09组 别 例数 GSH（nmol／L） GSH／GSSG CoQ10（U／L） SOD 抑制率（%） TAC（U／ml）对照组 23 0.15±0.22 2.89±2.17 1 194.50±1 760.81 83.8 2±52.70 8.59±2.05 PCOS组 25 0.13±0.15 1.84±0.75＊1 090.40±1 326.46 71.23±6.17 7.83±2.36

四、两组临床结局比较

对照组有15例患者获得正常宫内妊娠（妊娠率71.43%）、6例患者未孕，2例患者未行新鲜胚胎移植；而PCOS组（25例）共有17例患者行新鲜胚胎移植，仅有6 例患者获得正常宫内妊娠（妊娠率35.29%），其他7例患者未孕，4例患者妊娠结局不良（2例生化妊娠流产、1 例异位妊娠、1 例胚胎停育），8例未移植。PCOS组正常宫内妊娠率显著低于对照组，差异有统计学意义（P＝0.026）。

讨 论

氧化应激（oxidative stress，OS）指机体活性氧（ROS）产生过多或抗氧化能力受损而引起的一种氧化／抗氧化失衡状态［14］。OS 对男性生殖健康的影响已有大量的研究报道［15-16］。但OS对女性卵母细胞及总体生殖功能的影响仍不十分明确［4］。近几年，在腹膜液、卵泡液和输卵管积水等重要的生殖微环境内都检测到ROS的存在［17-18］。在女性，OS的这种氧化／抗氧化失衡会引发一系列的生殖相关性疾病的发生，如：子宫内膜异位症、PCOS及不明原因性不孕［4］。已有研究指出，OS 可能参与PCOS的发生发展［9］，在PCOS患者中，OS可能通过诱导染色体和线粒体DNA 的损伤而直接降低PCOS患者的生育能力［19-20］。

本研究印证了在PCOS组基础的T、LH、LH／FSH 水平均高于对照组，即高雄激素及高LH／FSH 是PCOS临床中最常见的激素水平改变［11］。一项系统性Meta分析指出，行IVF 治疗的PCOS患者的周期取消率高、获卵率高，但临床受精率较低［21］。而Ludwig等［22］研 究 指 出，PCOS患 者 较 对照组有较高的获卵数、高的绝对受精卵数，MⅡ卵数无显著性差异；并有研究指出PCOS患者高LH 水平可降低卵母细胞质量，导致其流产率增高［23］，与本研究结果较为一致。本研究显示，与对照组比较PCOS组有较高的获卵数，且差异有统计学意义（P＝0.006），卵母细胞成熟率、受精率及IVF 优胚率两组间虽无统计学差异，但PCOS组的获卵数和绝对受精卵数是高于对照组的，而PCOS组的宫内妊娠率（35.29%）显著低于对照组（71.43%）。

通过检测卵泡液中相关的氧化应激指标，发现PCOS患者卵泡液中GSH／GSSG 较低，表明PCOS患者氧化应激反应较对照组显著，这与Duleba等［24］指出PCOS患者的细胞因子、各种白细胞、氧化应激指标均处于升高水平的结论一致。Chattopadhayay等［25］研究指出，相对于输卵管因素不孕的对照组，PCOS 组卵泡液中ROS、脂质过氧化物（LPO）水平升高，TAC 水平降低。本研究中MDA（MDA 是LPO 中的一种）、TAC在两组中也呈现出相似的趋势，但差异并无统计学意义。本研究中对照组妊娠结局优于PCOS组，提示OS 状态可能不利于妊娠。众多研究表明，卵泡液中OS 状态与IVF妊娠结局不良有直接关系，Das等［26］也提出卵泡液过量的ROS产生对卵母细胞成熟及随后的胚胎发育均有不利影响。

Takahashi等［27］指出，GSH 是卵母细胞和胚胎发育过程中抵御自由基伤害的主要的非酶类抗氧化物。GSH 在维持卵母细胞的健康发育中占重要地位［28］。GSH 是谷酰基循环通路中由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成的一种三肽醇，有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种存在形式，GSH 在维持细胞内还原状态、保护细胞免受氧化应激伤害中有其重要作用，GSH 在细胞和胚胎中不仅有其防御氧化损伤的作用，还起着多种重要作用，如参与DNA 合成、转录、细胞因子活化及凋亡过程［29］。本研究采用GSH／GSSG 水平来代表卵泡液中整体氧化还原状态，以揭示其氧化应激程度，GSH 与GSSG 为同一物质的两种状态，因而认为GSH／GSSG 比值或许优于其他指标，更能反映氧化应激的氧化／抗氧化的失衡状态。目前研究者多数用ROS、SOD、MDA、TAC 等反映氧化应激状态，现已知晓ROS包括多种分子如超氧自由基、过氧化氢、羟自由基等，每种分子都按照不同的信号通路发挥着各自的作用。而SOD 虽然作为一线抗氧化物，但体内抗氧化物多种多样：酶类、非酶类等，也不能以一概全。

综上所述，相比于因输卵管因素不孕的对照组，PCOS患者卵泡液中确实存在氧化还原失衡的氧化应激状态。本研究存在的不足之处在于未对所收集卵泡液的相应卵母细胞进行单一受精、移植过程的追踪，本研究只用单一卵泡液的氧化应激水平粗略代表患者的整体氧化应激状态，显然有其不足之处。另有研究指出，补充多种维生素和矿物质可通过加强机体抗氧化防御系统而降低IVF 中的氧化应激水平［30］，而氧化应激水平与IVF妊娠结局不良有直接关系［31-32］。通观本研究结果，可以认为PCOS患者体内存在异于正常的OS状态，而这种OS状态与妊娠结局有关，故提示在ART 治疗中若通过抗氧化治疗或许可改善PCOS患者的IVF临床结局。

［1］ Hart R，Hickey M，Franks S.Definitions，prevalence and symptoms of polycystic ovaries and polycystic ovary syndrome［J］.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2004，18：671-683.

［2］ 方健叶，杨菁，赵庆红，等.多囊卵巢综合征患者体外受精-胚胎移植不同降调节方案的比较［J］.生殖医学杂志，2012，21：436-439.

［3］ Teede H，Deeks A，Moran L.Polycystic ovary syndrome：a complex condition with psychological，reproductive and metabolic manifestations that impacts on health across the lifespan［J］.BMC Med，2010，8：41-51.

［4］ Agarwal A，Aponte-Mellado A，Premkumar BJ，et al.The effects of oxidative stress on female reproduction：a review［J］.Reprod Biol Endocrinol，2012，10：49-80.

［5］ Seleem AK，El Refaeey AA，Shaalan D，et al.Superoxide dismutase in polycystic ovary syndrome patients undergoing intracytoplasmic sperm injection［J］.J Assist Reprod Genet，2014，31：499-504.

［6］ 曹泽毅 主编.中华妇产科学［M］.第2版.北京：人民卫生出版社，2005：2449-2456.

［7］ Escobar-Morreale HF，Luque-Ramírez M，González F.Circulating inflammatory markers in polycystic ovary syndrome：a systematic review and meta analysis［J］.Int J Fertil Steril，2011，95：1048-1058.

［8］ Fauser BC，Tarlatzis BC，Rebar RW，et al.Consensus on women’s health aspects of polycystic ovary syndrome（PCOS）：the Amsterdam ESHRE／ASRM-Sponsored 3rd PCOS Consensus Workshop Group［J］.Int J Fertil Steril，2012，97：28-38.

［9］ Murri M，Luque-Ramírez M，Insenser M，et al.Circulating markers of oxidative stress and polycystic ovary syndrome（PCOS）：a systematic review and meta-analysis［J］.Hum Reprod Update，2013：1-21.

［10］ Carbone MC，Tatone C，Delle Monache S，et al.Antioxidant enzymatic defences in human follicular fluid：characterization and age‐dependent changes［J］.Mol Hum Reprod，2003，9：639-643.

［11］ Gao H，Meng J，Xing H，et al.Association of heme oxygenase-1with the risk of polycystic ovary syndrome in non-obese women［J］.Hum Reprod，2014，29：1058-1066.

［12］ Genazzani AD，Santagni S，Rattighieri E，et al.Modulatory role of D-chiro-inositol（DCI）on LH and insulin secretion in obese PCOS patients［J］.Gynecol Endocrinol，2014，30：438-443.

［13］ Heijnen E，Eijkemans MJC，Hughes EG，et al.A metaanalysis of outcomes of conventional IVF in women with polycystic ovary syndrome［J］.Hum Reprod Update，2006，12：13-21.

［14］ Al-Gubory KH，Fowler PA，Garrel C.The roles of cellular reactive oxygen species，oxidative stress and antioxidants in pregnancy outcomes［J］.Int J Biochem Cell Biol，2010，42：1634-1650.

［15］ Makker K，Agarwal A，Sharma R.Oxidative stress ＆ male infertility［J］.Indian J Med Res，2009，129：357-367.

［16］ Cummins JM，Jequier AM，Kan R.Molecular biology of human male infertility：links with aging，mitochondrial genetics，and oxidative stress？［J］.Mol Reprod Dev，1994，37：345-362.

［17］ Oyawoye O，Gadir AA，Garner A，et al.Antioxidants and reactive oxygen species in follicular fluid of women undergoing IVF：relationship to outcome［J］.Hum Reprod，2003，18：2270-2274.

［18］ Bedaiwy MA，Goldberg JM，Falcone T，et al.Relationship between oxidative stress and embryotoxicity of hydrosalpingeal fluid［J］.Hum Reprod，2002，17：601-604.

［20］ Sabuncu T，Vural H，Harma M，et al.Oxidative stress in polycystic ovary syndrome and its contribution to the risk of cardiovascular disease［J］.Clin Biochem，2001，34：407-413.

［21］ Heijnen E，Eijkemans MJC，Hughes E G，et al.A metaanalysis of outcomes of conventional IVF in women with polycystic ovary syndrome［J］.Hum Reprod Update，2006，12：13-21.

［22］ Ludwig M，Finas DF，Al-Hasani S，et al.Oocyte quality and treatment outcome in intracytoplasmic sperm injection cycles of polycystic ovarian syndrome patients［J］.Hum Reprod，1999，14：354-358.

［23］ Homburg R，Armar NA，Eshel A，et al.Influence of serum luteinising hormone concentrations on ovulation，conception，and early pregnancy loss in polycystic ovary syndrome［J］.BMJ，1988，297：1024-1026.

［24］ Duleba AJ，Dokras A.Is PCOS an inflammatory process？［J］.Fertil Steril，2012，97：7-12.

［25］ Chattopadhayay R，Ganesh A，Samanta J，et al.Effect of follicular fluid oxidative stress on meiotic spindle formation in infertile women with polycystic ovarian syndrome［J］.Gynecol Obstet Invest，2009，69：197-202.

［26］ Das S，Chattopadhyay R，Ghosh S，et al.Reactive oxygen species level in follicular fluid-embryo quality marker in IVF？［J］.Hum Reprod，2006，21：2403-2407.

［27］ Takahashi M，Nagai T，Hamano S，et al.Effect of thiol compounds on in vitro development and intracellular glutathione content of bovine embryos［J］.Biol Reprod，1993，49：228-232.

［28］ Zuelke KA，Jeffay SC，Zucker RM，et al.Glutathione（GSH）concentrations vary with the cell cycle in maturing hamster oocytes，zygotes，and pre‐implantation stage embryos［J］.Mol Reprod Dev，2003，64：106-112.

［29］ Takahashi M.Oxidative stress and redox regulation on in vitro development of mammalian embryos［J］.J Reprod Dev，2012，58：1-9.

［30］ Hernández Guerrero CA，Bujalil Montenegro L，de la Jara Díaz J，et al.Endometriosis and deficient intake of antioxidants molecules related to peripheral and peritoneal oxidative stress［J］.Ginecol Obstet Mex，2006，74：20-28.

［31］ Borowiecka M，Wojsiat J，Polac I，et al.Oxidative stress markers in follicular fluid of women undergoing in vitro fertilization and embryo transfer［J］.Syst Biol Reprod Med，2012，58：301-305.

［32］ 宋亚丽，全松，田建伟，等.卵泡液中蛋白氧化水平与IVFET 结局参数的关 系［J］.南方医科大学学报，2009，29：160-163.