黄花棘豆抑制植物病原菌的活性成分研究

杨震发, 袁呈山, 杨顺义*, 柳利龙, 杨晋伟, 沈慧敏

(1.甘肃农业大学草业学院,兰州 730070；2.兰州大学 功能有机分子化学国家重点实验室,兰州 730000)

黄花棘豆抑制植物病原菌的活性成分研究

杨震发1, 袁呈山2, 杨顺义1*, 柳利龙1, 杨晋伟2, 沈慧敏1

(1.甘肃农业大学草业学院,兰州 730070；2.兰州大学 功能有机分子化学国家重点实验室,兰州 730000)

为了测定黄花棘豆(OxytropisochrocephalaBunge)提取物对常见病原真菌的活性，明确其中的有效成分，以黄花棘豆为材料，结合生物活性追踪法，对黄花棘豆的抑菌活性物质进行分离，并利用现代波谱学技术进行结构鉴定。结果表明，黄花棘豆乙醇提取物对供试4种病原真菌均表现出较强的活性，10 mg/mL对番茄灰霉病菌的抑菌率达到82.08 %；粗提物萃取后的二氯甲烷相和乙酸乙酯相为其活性部分，10 mg/mL对番茄灰霉病菌的抑菌率分别为84.30 %和83.13 %；从合并后的二氯甲烷和乙酸乙酯相中分离、鉴定得到了6个化合物，其中3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷、3-羟基-9-甲氧基紫檀烷和3-羟基-8,9-二甲氧基紫檀烷对供试病原菌表现较好的抑制活性；3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷对番茄灰霉病菌的EC50值为10.42 μg/mL,3-羟基-8,9-二甲氧基紫檀烷对黄瓜枯萎病菌的EC50值为27.09 μg/mL。黄花棘豆提取物对病原真菌具有较好的抑制活性，紫檀烷类化合物为其主要的活性成分，具备进一步开发和应用的潜力。

黄花棘豆; 活性跟踪; 分离鉴定; 抑菌成分; 紫檀烷

化学农药的长期使用带来了有害生物的抗药性、残留毒性及环境污染等问题[1]。随着人类可持续发展战略的实施，符合健康、环保、持续发展理念的高效、低毒、低残留、与环境相融的农药成为当今农药研究开发的主题[2-3]。与化学农药相比，植物源农药具有选择性高、低毒、易降解、有害生物不易产生抗性等优点[4]。据报道，在中国有1 600种重要的作物有害生物，其中约720种是病原物，占近45%，杀菌剂的研究开发任重道远，继续寻找高活性的植物源杀菌剂是新农药开发及植物病害防治的重要基础工作[5-6]。黄花棘豆(OxytropisochrocephalaBunge)是豆科棘豆属多年生草本有毒植物[7]，化学成分主要包括黄酮类、三萜类、生物碱类、糖类等，主要具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、免疫抑制、清除和诱导自由基活性等药理作用[8-9]。曹光荣等[10]从黄花棘豆中分离出吲哚兹定生物碱-苦马豆素，并证实这种生物碱对α-甘露糖甙酶有抑制作用，是引起羊中毒的主要原因。邓建梅等[11]对12种有毒植物化感作用的对比研究发现，黄花棘豆的甲醇提取物对油菜、燕麦和反枝苋的幼苗生长有较强的抑制作用。李翔等[12]对黄花棘豆化感作用机理的研究中发现，黄花棘豆水提液对燕麦和油菜幼苗的有丝分裂有抑制作用。黄花棘豆对常见病原真菌活性方面还没有研究报道。本试验利用活性追踪法，研究黄花棘豆对常见植物病原真菌的抑制活性，并从活性部位中分离活性物质，以期明确黄花棘豆中的抑菌活性成分及对其敏感的病原真菌，为开发利用该种植物资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物

黄花棘豆于2011年7月采自甘肃省武威天祝县天然草地。选用生长良好的开花期黄花棘豆全株，阴凉处晾干，剪碎后密封，置于0～4 ℃冰箱中保存备用。

1.1.2 供试菌种

番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.exFr.)、马铃薯丝核病菌(RhizoctoniasolaniKühn)、黄瓜枯萎病菌(FusariumoxysporumSchl.)、番茄早疫病菌[Alternariasolani(EllisetMartin) JonesetGrout]和小麦根腐菌[Bipolarissorokiniana(Sacc.) Shoem]等，均由甘肃农业大学草业学院农药实验室提供。

1.1.3 仪器与试剂

Bruker AV-400型核磁共振仪；薄层层析硅胶GF254、柱层析色谱硅胶HF254(200～300 目、300～400 目)(青岛海洋化工厂生产)；MCI(日本三菱化学品公司)；Sephadex LH-20(德国默克公司)；LDZX-30 kBS高压蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；R205B型、R502型旋转薄膜蒸发仪(上海申生科技有限公司)；ZRD-5030型全自动型鼓风干燥箱(上海智域分析仪器制造有限公司)；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、甲醇、丙酮等均为分析纯。50%多菌灵可湿性粉剂(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 黄花棘豆提取溶剂及敏感菌的筛选

以乙醇和丙酮作为提取溶剂，以番茄灰霉病菌、马铃薯丝核病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌和小麦根腐菌作为供试菌，不同溶剂提取物对不同病原真菌进行抑菌活性测定，通过对比筛选出最适提取溶剂和最敏感病原菌。

1.2.2 黄花棘豆活性物质的提取及初步分离

称取自然干燥的黄花棘豆全株8.6 kg，适当粉碎后，用95%乙醇加热提取3次(温度控制在40 ℃左右)，每次3 d，提取液减压浓缩得820 g浸膏，取少量浸膏用乙醇溶解定容至浓度为10.0 mg/mL。将剩余的浸膏溶解于1.5 L水中，依次用石油醚(30～60 ℃,1.0 L)、二氯甲烷(1.0 L)、乙酸乙酯(1.0 L)、正丁醇(1.0 L)萃取3次，3次萃取液合并后进行减压浓缩，得到石油醚部分浸膏(106.4 g)、二氯甲烷部分浸膏(85.6 g)、乙酸乙酯部分浸膏(92.0 g)、正丁醇部分浸膏(125.2 g)，分别取4个相的浸膏少许，后用相应溶剂溶解定容至浓度为10 mg/mL，在4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 黄花棘豆抑菌成分的分离鉴定

黄花棘豆的4个萃取相经抑菌活性追踪发现，二氯甲烷相和乙酸乙酯相对番茄灰霉菌的活性明显高于石油醚相和正丁醇相。合并的二氯甲烷相和乙酸乙酯相进行硅胶柱层析(200～300目，石油醚∶丙酮=100∶1…1∶1,0∶1和甲醇)梯度洗脱，TLC检测合并得到6个组分Fr.1(22.6 g)、Fr.2(18.3 g)、Fr.3(32.5 g)、Fr.4(27.1 g)、Fr.5(30.2 g)、Fr.6(24.4 g),分别取6个组分少许后用相应溶剂溶解定容至浓度为10.0 mg/mL。对其中抑菌活性好的组分进一步分离，用硅胶柱层析(石油醚/丙酮60∶1…1∶1,0∶1,甲醇)进行梯度洗脱，TLC检测合并相同组分，分别进行Sephadex LH-20(CHCl3/CH3OH 1∶1)柱层析，再用MCI凝胶层析(水∶甲醇=3∶1…1∶5)纯化，反复硅胶(300～400目)柱层析得到化合物1(2.9 mg)、化合物2(13.7 mg)、化合物3(14.8 mg)、化合物4(5.9 mg)、化合物5(17.5 mg)和化合物6(11.4 mg)。

测熔点，根据质谱、核磁共振图谱数据结合相关文献解析化合物的结构。

1.2.4 生物活性测定方法

生长速率法[13]，在常温、无菌条件下，取1 mL提取液至25 mL刻度试管，对照组加入等量对应溶解溶剂，再倒入融化的PDA培养基至10 mL，充分混匀后在50～55 ℃时，倒入90 mm培养皿中制成平板，平板凝固后接入生长一致的菌饼(d=0.5 cm)。每皿接1个菌饼，每处理重复3次，25～27 ℃培养并观察结果。用十字交叉法测量供试真菌菌落生长直径，用下述公式计算抑制率：

菌落直径(cm)=测量菌落直径平均值-0.5;

1.2.5 数据分析

用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。

2 结果

2.1 黄花棘豆不同溶剂提取物对供试菌抑制作用

两种不同溶剂提取物对5种供试病原菌表现不同程度的抑制活性，结果见表1。乙醇提取物对番茄灰霉菌的抑菌率高于其他供试菌，并且乙醇提取物的活性高于丙酮提取物的活性。两种提取物对5种供试病原真菌的活性显著高于50 %多菌灵可湿性粉剂的活性。由于黄花棘豆乙醇提取物和黄花棘豆丙酮提取物对番茄灰霉病菌的抑制活性相对最高且差异不显著，但是乙醇较丙酮安全、便宜，因此选择乙醇作为提取溶剂，选择最敏感的番茄灰霉病菌作为后续试验供试菌。

表1 黄花棘豆不同溶剂提取物对供试菌的抑菌作用1)Table 1 Antifungal activity of different solvent extracts from Oxytropis ochrocephala

1) 表中数据均为3次重复的平均值，同列数据后不同小写字母表示经Duncan氏多重比较在P=0.05水平上差异显著，下同。黄花棘豆提取物浓度为10.0 mg/mL，50%多菌灵可湿性粉剂浓度为0.5 mg/mL(对照药剂浓度同表3、表4)。
Data in the table were the means of three replicates; different letters in each column indicate significant difference atP=0.05 by Duncan’s multiple comparison. The same below. The concentration of the extract ofO.ochrocephalawas 10.0 mg/mL and the concentration of 50% carbendazol WP was 0.5 mg/mL(the concentration of the control was described below).

2.2 黄花棘豆乙醇提取物的4个萃取相对番茄灰霉病菌的抑制作用

黄花棘豆乙醇提取物的4个萃取相对番茄灰霉病菌的抑菌作用结果如表2。黄花棘豆乙醇提取物的石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相和正丁醇4个萃取相中，在浓度为10.0 mg/mL时，二氯甲烷相和乙酸乙酯相对番茄灰霉病菌的抑制活性显著高于石油醚相和正丁醇相，且抑菌率均大于80 %，极显著高于50 %多菌灵可湿性粉剂，因此二氯甲烷相和乙酸乙酯相为黄花棘豆乙醇提取物的相对高活性部位。

2.3 二氯甲烷和乙酸乙酯混合相的6个组分对番茄灰霉病菌的抑制活性

在3个不同浓度时，Fr.3组分和Fr.4组分对番茄灰霉病菌的抑制活性显著高于其他4个组分，也显著高于50 %多菌灵可湿性粉剂，Fr.3组分和Fr.4组分对番茄灰霉病菌的抑制活性差异不显著，在浓度为10.0 mg/mL时对番茄灰霉病菌的抑菌率最大，分别为81.35 %和80.75 %。因此Fr.3组分和Fr.4组分为二氯甲烷和乙酸乙酯混合相的相对高活性部位，对其继续进行分离研究。

表2 黄花棘豆乙醇提取物的不同萃取相对番茄灰霉菌的抑菌作用Table 2 Antifungal activity of ethanol extract from Oxytropis ochrocephala againstBotrytis cinerea in different extraction phases and at different concentrations

表3 二氯甲烷和乙酸乙酯混合相的6个组分在不同处理浓度时对番茄灰霉菌的抑制作用Table 3 Antifungal activity of six fractions fromincorporative methylene chloride and ethylacetatephase against Botrytis cinerea at different concentrations

2.4 黄花棘豆抑菌成分鉴定

对Fr.3和Fr.4两部分通过反复硅胶(300～400 目)柱层析，通过Sephadex LH-20(CHCl3∶CH3OH=1∶1)柱层析和MCI层析纯化，最后分离得到了6个化合物，通过理化性质、ESI-MS、1H NMR、13C NMR和与文献对照的方法，鉴定为:(1)豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮、(2)3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷、(3)3-羟基-9-甲氧基紫檀烷、(4)3β-羟基-羽扇豆烷、(5)3-羟基-8,9-二甲氧基紫檀烷和(6)3β-羟基-12-烯-齐墩果烷。6个化合物的波谱数据如下：

化合物(1):白色无定形粉末;1H NMR(300 mHz,CDCI3):δ=5.68(1 H,s,H-6),3.68(1 H,m,H-3),2.5(1 H,ddd,J=14.5,5.4,1.8Hz,H-4a),2.39(1 H,m,H-4 b),2.24(1 H,t,J=11.1 Hz,H-8),1.19(3H,s,H-19),0.92(3H,d,J=6.6Hz,H-21),0.85(3H,t,J=7.5Hz,H-29),0.83(3H,d,J=6.6Hz,H-26),0.81(3H,d,J=6.6Hz,H-27),0.66(3H,s,H-18)。查阅文献[14]并与文献中的数据对照，确定豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮(stigmast-5-en-3β-ol-7-one)的数据与上述数据基本一致。

化合物(2):无色柱状结晶(CHCl3-MeOH);ESI-MS(+)m/z:300.8(M++1);1H NMR(400 mHz,CDCI):δ=7.13(1H,d,J=8.4Hz,H-1),6.58(1H,d,J=8.4Hz,H-2),3.66(1H,m,H-6a),4.41(1H,d,J=9.2,6.4 Hz,H-6α),3.62(1H,m,H-6β),7.27(1H,d,J=8.0 Hz,H-7),6.49(1H,d,J=8.0,2.4Hz,H-8),6.45(1H,d,J=2.4Hz,H-10),5.58(1H,d,J=6.8 Hz,H-11a),3.72,3.69(3H,s,4-OCH3,9-OCH3),9.40(1H,s,OH-3);13C NMR(100 mHz,CDCI):δ=125.6(C-1),109.9(C-2),135.5(C-3),150.9(C-4),160.5(C-4a),66.1(C-6),40.8(C-6a),119.3(C-6 b),125.2(C-7),105.9(C-8),149.5(C-9),96.3(C-10),160.2(C-10a),78.1(C-11a),112.5(C-11 b),60.1(4-OCH3),55.2(9-OCH3)。查阅文献[15]并与文献中的数据对照，确定3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷的数据与上述数据基本一致。

化合物(3):棕色粒状固体(Acetone);ESI-MS(+)m/z:271.2(M++1).1H NMR(400 mHz, CDCI)δ:8.48(3-OH),7.30(1H,d,J=8.5Hz,H-1),7.16(1H,d,J=8Hz,H-7),6.51(1H,dd,J=8.5,2.5Hz,H-2),6.40(1H,dd,J=8,2Hz,H-8),6.35(1H,d,J=2Hz,H-10),6.33(1H,d,J=2.5Hz,H-4),5.47(1H,d,J=7Hz,H-11a),4.24(1H,d,J=10.5,4.5Hz, H-6α),3.70(3H,s,MeO-9),3.52(2H,m,H-6a,H-6β).13C NMR(100 mHz,CDCI):δ=132.2(C-1),109.8(C-2),156.7(C-3),103.7(C-4),157.0(C-4a),66.6(C-6),39.4(C-6a),119.1(C-6 b),124.8(C-7),106.5(C-8),161.3(C-9),96.9(C-10),160.7(C-10a),78.5(C-11a),112.6(c-11 b),55.5(9-OCH3)。查阅文献[16]并与文献中的数据对照，确定3-羟基-9-甲氧基紫檀烷的数据与上述文献中的数据基本一致。

化合物(4):白色无定形粉末;分子式C30H50O;1H NMR(400 MHz,CDCI3):δ=4.66(1H,s,H-29),4.54(1H,s,H-29),3.36(1H,dd,J=11.2,5.2Hz,H-3);13C-NMR(100 mHz,CDCI3):δ=150.9(C-29,t),76.2(C-3,d),50.2(C-5,d),49.0(C-9,d),48.3(C-18,d),48.1(C-19,d),43.1(C-10,s),42.9(C-17,d),41.1(C-14,s),40.1(C-8,s),38.1(C-22,t),37.6(C-13,d),37.3(C-4,s),35.7(C-2,t),34.2(C-16,t),33.3(C-7,t),29.9(C-21,t),28.4(C-23,q),27.5(C-15,t),25.5(C-12,t),25.2(C--11,t),22.2(C-30,q),20.9(C-1,t),19.4(C-28,q),18.3(C-6,t),18.1(C-26,q),16.1(C-24,q),16.0(C-27,q),14.7(C-25,q)。查阅文献[17]并与文献中的数据对照，确定3β-羟基-羽扇豆烷的数据与上述文献中的数据基本一致。

化合物(5):白色针晶(CHCl3-MeOH);ESI-MS(+)m/z:301.1(M++1).1H NMR(400 mHz, CDCI),δ:7.92(3-OH),7.25(1H,d,J=8Hz,H-1),7.06(1H,s,H-7),6.49(1H,dd,J=8,2Hz,H-2),6.44(1H, m,H-10),6.44(1H,d,J=2Hz,H-4),5.52(1H,d,J=7Hz,H-11a),4.29(1H,dd,J=10.5,4.5Hz,H-6α), 3.90(3H,s,MeO-9),3.77(3H,s,MeO-8),3.65(2H,m,H-6a,H-6β)。查阅文献[15]并与文献中的数据对照，确定3-羟基-8,9-二甲氧基紫檀烷的数据与上述文献中的数据基本一致。

化合物(6):白色无定形粉末;1H NMR(400 MHz,CDCI3):δ=5.27(1H,s,H-12),3.15(1H,dd,J=10.4,4.8Hz,H-3),1.03(3H,s,H-28),1.01(3H,s,H-27),0.99(3H,s,H-26),0.94(3H,s,H-30),0.87(3H,s,H-29),0.83(3H,s,H-23),0.79(3H,s,H-25),0.77(3H,s,H-24);13C NMR(100 mHz,CDCI3):δ=143.3(C-13,s), 121.8(C-12,d), 78.2(C-3,d), 54.6(C-5,d), 47.7(C-9,d), 46.4(C-19,t), 46.5(C-17,s), 42.1(C-14,s), 41.2(C-18,d), 40.8(C-8,d), 38.7(C-4,s), 38.1(C-1,t), 38.0(C-10,s), 36.4(C-21,t), 33.3(C-29,q), 32.3(C-7,t), 32.3(C-22,t), 32.1(C-20,s), 30.0(C-23,q), 27.4(C-2,t), 27.1(C-15,t), 26.1(C-27,q), 25.5(C-30,q), 22.8(C-11,t), 22.7(C-16,t), 22.4(C-6,t), 17.8(C-26,q), 16.2(C-25,q), 15.0(C-24,q)。查阅文献[17]并与文献中的数据对照，确定3β-羟基-12-烯-齐墩果烷的数据与上述文献中的数据基本一致。

2.5 化合物的抗菌作用比较

以番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌和马铃薯丝核菌为供试菌对分离得到的化合物进行活性筛选，结果表明化合物(2)、化合物(3)和化合物(5)对供试菌表现相对较高活性，化合物(2)和化合物(5)对番茄灰霉病菌的抑菌活性最高，EC50值分别为10.41 μg/mL和23.52 μg/mL。化合物(3)对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性最高，其EC50值为31.13 μg/mL，其次为番茄灰霉病菌，EC50值为38.81 μg/mL。化合物(2)和化合物(5)对黄瓜枯萎病菌也有很高的抑制活性，其EC50值分别为39.17 μg/mL和27.10 μg/mL，化合物(2)对马铃薯丝核菌也有高的抑制活性，其EC50值为21.10 μg/mL。3个化合物对番茄早疫病菌和马铃薯丝核菌抑制活性较低。

3 讨论

黄花棘豆中的主要成分包括甾体、三萜类、黄酮类、生物碱等，其中生物碱类是引起牲畜中毒的主要成分[8]。本文通过生物活性跟踪研究，从黄花棘豆乙醇提取物的活性部位中分离得到了6个化合物,分别为：豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮、3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷、3-羟基-9-甲氧基紫檀烷、3β-羟基-羽扇豆烷、3-羟基-8,9-二甲氧基紫檀烷和3β-羟基-12-烯-齐墩果烷。3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷具有广谱性，对供试菌均表现较高的活性。3-羟基-9-甲氧基紫檀烷和3-羟基-8,9-二甲氧基紫檀烷对番茄灰霉菌和黄瓜枯萎菌有较高的活性，上述3个化合物的抑菌活性均显著高于对照药剂，且3个化合物均属于紫檀烷类化合物。豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮、3β-羟基-羽扇豆烷和3β-羟基-12-烯-齐墩果烷对供试菌活性很低。紫檀烷类化合物在植物界中主要分布于豆科蝶形花亚科植物中，如香槐属、鹰嘴豆属、甘草属等一些植物中[18]。宋萍[19]等从鬼箭锦鸡儿中分离得到3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷和3-羟基-9-甲氧基紫檀烷，并证明其具有抗真菌和抗细菌活性。

表4 3种化合物对4种供试病原菌的毒力测定及EC50值Table 4 Toxicity test and EC50 of three compounds against four selected pathogenic fungi

在分离得到的6个化合物中，生物活性测定结果发现3个紫檀烷类化合物对供试菌的活性高于豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮、3β-羟基-羽扇豆烷和3β-羟基-12-烯-齐墩果烷，其中3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷对番茄灰霉菌的EC50值为10.41 μg/mL，其结果高于武夷菌素对番茄灰霉菌的抑制作用[20]。

黄花棘豆主要分布在我国西北、华北和西南地区的部分天然草场上，自然资源丰富，并且具有较好的抑菌活性和药理活性，该植物具备开发为新型植物源杀菌剂的潜力。

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AntifungalactivityandisolationofactiveingredientsinOxytropisochrocephala

Yang Zhenfa1, Yuan Chengshan2, Yang Shunyi1, Liu Lilong1, Yang Jinwei2, Shen Huimin1

(1.PrataculturalCollegeofGansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.StateKeyLaboratoryofAppliedOrganicChemistry,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)

In order to find new botanical antifungal compounds, antifungal ingredients ofOxytropisochrocephalaBunge were isolated. Using bioassay-guided fractionation methods, antifungal ingredients were isolated and monomeric compounds were identified by modern spectroscopy techniques fromO.ochrocephala. All data were processed statistically by using SPSS 17.0. Ethanol extract ofO.ochrocephalashowed strong activity against the selected pathogenic fungi with an inhibition ratio of 82.08 % at the concentration of 10 mg/mL. The methylene chloride and ethyl acetate phases displayed a significant antifungal activity againstBotrytiscinerea, with an inhibition ratio of 84.30% and 83.13%, respectively. Six compounds were isolated and identified through comparing the data obtained via spectroscopic methods and the values reported in the literature. The screening of antifungal activity showed that 3-hydroxy-4,9-dimethoxypterocarpan,3-hydroxy-9-dimethoxy pterocarpan and 3-hydroxy-8,9-dimethoxypterocarpan had higher EC50on tested fungi. The EC50of 3-hydroxy-4,9-dimethoxypterocarpan againstB.cinereawas 10.42 μg/mL and the EC50of 3-hydroxy-8,9-dimethoxypterocarpan againstFusariumoxysporumwas 27.09 μg/mL.O.ochrocephalacould be used as a biological antifungal agent and pterocarpan compounds are its significant antifungal ingredients.

Oxytropisochrocephala; bioassay-guided method; isolation and identification; active ingredient; pterocarpan

2013-12-21

：2014-03-19

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW-2004-08)；甘肃省教育厅基金项目(032-06)

S 482.292

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.011

* 通信作者 E-mail:yangshy@gsau.edu.cn