贵州省烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗药性

孟建玉, 汪汉成, 贾蒙骜, 曹 毅, 商胜华*, 赵 阳

(1. 贵州省烟草科学研究院, 贵阳 550081; 2. 江苏中烟工业有限责任公司, 南京 210019)

贵州省烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗药性

孟建玉1, 汪汉成1, 贾蒙骜1, 曹 毅1, 商胜华1*, 赵 阳2

(1. 贵州省烟草科学研究院, 贵阳 550081; 2. 江苏中烟工业有限责任公司, 南京 210019)

为了明确贵州地区烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗药性水平,从贵州省12个市、县采集黑胫病病株,经分离纯化鉴定,获得98株黑胫病菌株,采用生长速率法测定其对甲霜灵的敏感性。结果表明,采自不同地区的菌株对甲霜灵的敏感性差异较大,各供试菌株的EC50值分布范围为0.419 2～20.486 1 μg/mL；各地区平均EC50在0.551 9～10.986 0 μg/mL之间；最低抗药性水平为1.00,最高抗药性水平为48.87,相差48.87倍,各地区平均抗药性水平在1.32～26.21之间。遵义、兴仁、贵定、赫章和兴义有抗甲霜灵菌株出现,除遵义部分菌株的抗性水平表现为高抗外,其余菌株对甲霜灵产生的抗性均处于中抗水平。

烟草黑胫病菌； 甲霜灵； 抗药性

烟草黑胫病(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)是一种分布广泛、危害严重的世界性烟草主要病害,在我国除东北烟区零星发生外,其他烟区均有发生[1],目前主要通过化学农药进行防治。甲霜灵(metalaxyl)系列杀菌剂是防治烟草黑胫病的主要有效药剂,但由于该类药剂属于特异性位点抑制剂,对病原菌的作用位点单一,长期使用容易使病原菌对其产生抗药性,导致防治效果下降[2-3]。Shew[4-5]发现随着甲霜灵使用年限增加,ED50逐年升高,在0～3年中分别为0.3、0.4、0.7和1.2 μg/mL,证明连续使用甲霜灵会降低黑胫病菌对药剂的敏感性,即抗药性增加。Ferrin等[6]发现原始敏感菌系在甲霜灵用量为1 μg/mL时孢子囊形成就受到强烈抑制,而抗甲霜灵菌系在1、10和100 μg/mL用药量下都不受抑制。在国内,由于生产上使用农药种类较单一,云南、安徽、四川等地的烟草黑胫病菌已对甲霜灵产生了抗性,为达防治目标必须加大用药量[7-9]。贵州是我国重要的烟叶产地,一旦黑胫病菌普遍对甲霜灵产生抗性,将对该地区的烟叶产业造成严重影响。目前关于贵州烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗性水平尚未明确,为此,本研究对贵州不同地区的烟草黑胫病菌进行了抗药性检测,以期为指导烟草黑胫病的防治及田间病菌抗药性风险评估提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及药剂

供试菌株：分别从贵州省的遵义、兴仁、贵定、赫章、兴义、大方、务川、黔西、贞丰、金沙、凯里、织金12个市县采集患烟草黑胫病的烟株,保留患病的茎秆部分,在室内对其病原菌进行分离、纯化,于常温下试管保存备用[10]。共获得各地烟草黑胫病菌株98株。

供试药剂：98%甲霜灵(metalaxyl)原药,由贵州省农业科学院提供。

1.2 培养基

燕麦琼脂培养基：参考郑小波[10]的方法。称取燕麦片100 g,加入2 000 mL去离子水,在60 ℃恒温水浴锅中加热1 h后,用4层纱布过滤去渣,滤液用去离子水定容至2 000 mL,将其倒入全自动培养基制备机,加入琼脂粉36 g,121 ℃灭菌30 min,然后用全自动平皿分装机系统进行平板分装。

含药燕麦琼脂培养基配制：先将98%甲霜灵以丙酮为溶剂配成浓度为10 000 μg/mL的母液,置4 ℃冰箱中备用。测定时根据燕麦琼脂培养基的用量,吸取一定量的药剂母液,加入熔化并冷却至60 ℃的培养基中,配成含甲霜灵最终有效浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5和5 μg/mL的系列含药培养基。

1.3 敏感性测定方法

采用菌丝生长速率法测定[11]。将供试菌株接种于燕麦琼脂平板上,28 ℃黑暗条件下培养7 d后,用无菌打孔器切取直径为5 mm的菌饼,将菌饼正面朝下分别移到含甲霜灵浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5和5 mg/L的燕麦琼脂平板中央,以不含药平板为空白对照, 28 ℃恒温下暗培养,5 d后测量各处理的菌落直径,计算药剂对菌丝生长的抑制率。抑制率(%)=[1-(药剂处理的菌落直径-5)/(空白对照的菌落直径-5)]×100。每处理重复3次。

用各处理药剂浓度的对数值和菌丝生长抑制率的几率值进行线性回归分析,计算出甲霜灵对各参试菌株的抑制中浓度EC50[9]。抗性水平=供试菌株EC50/ 敏感菌株EC50,由于自然界中很难采集到未施药的敏感对照菌株,所以本文将所测菌株中最敏感菌株的EC50(0.4192 μg/mL)作为敏感基线[12-13]。抗性表型划分：敏感,EC50≤5.0 μg/mL；中抗,5.0 μg/mL10.0 μg/mL。根据抗性表型将供试菌株划分为敏感性菌株和抗性菌株。再根据抗性菌株在群体中出现的频率计算出抗性菌株频率。某地抗性菌株频率(%)=某地抗性菌株数/该地供试菌株数×100[14]。

2 结果与分析

2.1 烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性

贵州省不同烟草种植地区黑胫病菌对甲霜灵的敏感性差异很大。甲霜灵对所有供试菌株的EC50分布范围为0.419 2～20.486 1 μg/mL,平均EC50为3.378 9 μg/mL。最大EC50为20.486 1 μg/mL(Y=4.555 9+0.338 7X,r=0.980 1),菌株来源于遵义；最小EC50为0.419 2 μg/mL(Y=5.460 6+1.219 8X,r=0.955 2),菌株来源于贵定,最大EC50和最小EC50之间相差48.87倍(图1)。各地区平均EC50在0.551 9～10.986 0 μg/mL之间,织金菌株的平均EC50为0.551 9 μg/mL,遵义菌株的平均EC50为10.986 0 μg/mL,其他各地区介于这两个地区之间(表1)。

图1 贵州省烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性分布

2.2 烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗性水平

贵州省各地区供试黑胫病菌对甲霜灵的平均抗性水平在1.32～26.21之间,平均抗性水平最低的为织金,最高的为遵义(图2)。供试的98个菌株中对甲霜灵最低的抗性水平为1.00,最高抗性水平为48.87(表2),相差48.87倍。其中,遵义的抗性水平在14.49～48.87之间,兴仁的抗性水平在1.79～22.04之间,贵定的抗性水平在1.00～19.95,赫章的抗性水平在4.51～16.26之间,兴义的抗性水平在3.68～12.02之间,大方的抗性水平在1.04～10.51之间,务川的抗性水平在1.34～6.24之间,黔西的抗性水平在1.63～6.68之间,贞丰的抗性水平在3.50～4.89之间,金沙的抗性水平在1.22～4.66之间,凯里的抗性水平在2.81～3.72之间,织金的抗性水平为1.32。其中,抗性水平最低的菌株来源于贵定,抗性水平最高的菌株来源于遵义(表2)。

表1贵州省不同地区烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性比较

Table1ComparisonofthesensitivityofP.parasiticacollectedfromdifferentdistrictsinGuizhouProvincetometalaxyl

地区District菌株数No．ofisolatesEC50分布范围/μg·mL-1EC50EC50平均值/μg·mL-1AverageEC50遵义Zunyi76．0744～20．486110．9860兴仁Xingren410．7514～9．24073．6452贵定Guiding60．4192～8．36422．9625赫章Hezhang61．8899～6．81693．6632兴义Xingyi61．5426～5．03713．0603大方Dafang60．4361～4．40211．6551务川Wuchuan70．5631～2．85891．4228黔西Qianxi70．6844～2．80171．6026贞丰Zhenfeng41．4689～2．05111．7299金沙Jinsha40．5134～1．95391．0264凯里Kaili31．1781～1．56121．3257织金Zhijin10．5519～0．55190．5519

图2 贵州省不同地区烟草黑胫病菌对甲霜灵的平均抗性水平

2.3 不同地区抗性菌株频率分布

贵州省各地区抗性菌株频率统计结果表明,大方、务川、黔西、贞丰、金沙、凯里、织金的烟草黑胫病菌株未对甲霜灵产生抗性,其余各地区均出现了一定比例抗性菌株,其中以遵义的抗性菌株频率最高,达100%,其次是兴仁的抗性菌株频率为21.95%,贵定、赫章和兴义的抗性菌株频率均为16.67%。兴仁、贵定、赫章、兴义大部分菌株对甲霜灵仍表现为敏感,只有少部分的菌株产生了中抗；遵义的所有供试菌株均对甲霜灵产生了抗性,呈现为中抗或高抗,其抗性频率分别为57.14%和42.86%(表2)。

表2贵州省不同地区烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗性频率

Table2ResistancefrequencyofP.parasiticacollectedfromdifferentdistrictsinGuizhouProvincetometalaxyl

地区District抗性菌株No．ofresistantisolates最低抗性水平Lowestresistancelevel最高抗性水平Highestresistancelevel抗性频率/%Resistancefrequency不同抗性水平的菌株频率/%Frequencyofisolateswithdifferentresistancelevels敏感Sensitive中抗Middle高抗High遵义Zunyi714．4948．87 1000．0057．1442．86兴仁Xingren91．7922．0421．9578．0521．950．00贵定Guiding11．0019．9516．6783．3316．670．00赫章Hezhang14．5116．2616．6783．3316．670．00兴义Xingyi13．6812．0216．6783．3316．670．00大方Dafang01．0410．510．00 1000．000．00务川Wuchuan01．346．240．00 1000．000．00黔西Qianxi01．636．680．00 1000．000．00贞丰Zhenfeng03．504．890．00 1000．000．00金沙Jinsha01．224．660．00 1000．000．00凯里Kaili02．813．720．00 1000．000．00织金Zhijin01．321．320．00 1000．000．00

3 讨论

随着甲霜灵在防治烟草黑胫病上的大量使用,其抗性已成为生产上一个不容忽视的问题。为弄清贵州烟草黑胫病菌对甲霜灵是否产生抗药性,从贵州12个市县采集了98株烟草黑胫病菌,对其抗药性进行了检测。因为甲霜灵在贵州烟草生产上使用了许多年,采集从未用药的标准野生敏感菌株很难,本文敏感基线的确定参照文献[12-13]的方法,将供试菌株中最敏感菌株的EC50作为敏感基线。研究发现,贵州省不同地区的烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性差异很大,来自不同地区的菌株中敏感、中抗和高抗菌株的比例有较大差异,其原因可能与菌株来源、各地用药水平及防治历史有关。在抗性水平测定中,遵义、兴仁、贵定、赫章和兴义有抗甲霜灵菌株出现,其中遵义地区的抗性菌株频率最高,达到100%,且部分菌株已达到高抗水平；其次为兴义地区,其抗性频率为21.95%。这是因为遵义和兴仁为贵州省种植烟草的老烟区,烟农在防治黑胫病时习惯于连年使用甲霜灵,且加大了用药次数和剂量,给病原菌产生抗药性创造了极为有利的条件。这也间接说明不同地区由于用药程度上存在差别,其抗药性就存在明显差别。

根据抗性监测结果,目前对于贵州省而言,敏感菌株仍是优势类群,说明贵州省的烟草黑胫病菌尚未大面积对甲霜灵产生抗性,对大部分植烟区只要加强农业栽培措施的管理,定期做好抗性监测工作,注意甲霜灵与其他农药的交替和轮换使用,甲霜灵仍可作为防治黑胫病的有效药剂。但对遵义、兴仁、贵定、赫章等已表现中抗、高抗的地区使用甲霜灵防治黑胫病存在较大的抗性风险,应尽可能减少甲霜灵使用频次及用量或者直接停止使用,建议生产上使用烯酰吗啉进行防治[3, 15],最大限度地阻止抗性群体的发展蔓延。

[1]孔凡玉,朱贤朝,石金开,等. 我国烟草侵染性病害发生趋势及防治对策[J]. 中国烟草,1995,16(1)：31-34.

[2]Gisi U, Cohen Y. Resistance to phenylamide fungicides: a case study withPhytophthorainfestansinvolving mating type and race structure [J]. Annual Review of Phytopathology, 1996, 34: 549-572.

[3]戚仁德,丁建成,高智谋,等. 安徽省辣椒疫霉对甲霜灵的抗药性监测[J]. 植物保护学报,2008,35(3)：245-250.

[4]Shew H D. In vitro growth response ofPhytophthoraparasiticavar.nicotianaeisolates to metalaxyl[J]. Plant Disease,1984,68:764-766.

[5]Shew H D. Response ofPhytophthoraparasiticavar.nicotianaeto metalaxyl exposure [J]. Plant Disease, 1985,69:559-562.

[6]Ferrin D M, Wadsworth M L. Effect of metalaxyl on sporulation and growth of metalaxyl-resistant and metalaxyl-sensitive isolates ofPhytophthoraparasiticainvitro[J]. Plant Disease,1992,76:492-495.

[7]王革,郑小波,陆家云,等. 云南省烟草黑胫病菌对甲霜灵抗性的检测[J]. 南京农业大学学报,1997,20(4)：105-107.

[8]马国胜. 烟草黑胫病菌生理生态及对甲霜灵抗性监测与遗传研究[D]. 合肥:安徽农业大学,2002：67-87.

[9]袁洁,杨学辉,何海永,等. 贵州省稻瘟病菌对稻瘟灵的抗药性研究[J]. 植物保护,2006,32(1)：66-68.

[10]郑小波. 疫霉菌及其研究技术[M]. 北京：中国农业出版社,1997.

[11]高智谋,郑小波,陆家云. 苎麻疫霉对甲霜灵抗性的遗传研究[J]. 南京农业大学学报,1997,20(3)：54-59.

[12]曹学仁,赵文娟,周益林,等. 2007年我国部分麦区小麦白粉菌对三唑酮的抗药性监测[J].植物保护,2008,34(6)：74-77.

[13]李梅云,祝明亮.烟草赤星病菌对菌核净的抗药性测定[J].西南农业学报,2007,20(3)：412-416.

[14]赵晓军,任璐,周建波,等. 山西省蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检测[J]. 植物保护,2012,38(5)：120-123.

[15]胡燕,王开运,许学明,等. 烯酰吗啉对我国烟草黑胫病菌的毒力研究[J]. 农药学学报,2006,8(4)：339-343.

ResistanceofPhytophthoraparasiticavar.nicotianaetometalaxylinGuizhouProvince

Meng Jianyu1, Wang Hancheng1, Jia Meng’ao1, Cao Yi1, Shang Shenghua1, Zhao Yang2

(1.GuizhouTobaccoResearchInstitute,Guiyang550081,China;2.ChinaTobaccoJiangsuIndustrialCo.,Ltd.,Nanjing210019,China)

In order to investigate the resistance level ofPhytophthoraparasiticavar.nicotianaeto metalaxyl in Guizhou Province, samples of tobacco black shank were collected in major tobacco growing areas in 12 cities and counties of the province, and 98P.parasiticastrains were isolated. The sensitivity of these strains to metalaxyl was determined by mycelial growth rate. The results showed that the sensitivity ofP.parasiticafrom different districts differed significantly, with EC50values ranged from 0.419 2 to 20.486 1 μg/mL and the average EC50value between 0.551 9 and 10.986 0 μg/mL. The lowest and the highest resistance level were 1.00 and 48.87, respectively. The average resistance level ofP.parasiticafrom different districts was between 1.32 and 26.21. The resistant isolates existed in Zunyi, Xingren, Guiding, Hezhang and Xingyi regions. The resistance levels of some strains in Zunyi were high, but the other strains were at the middle resistance level.

Phytophthoraparasiticavar.nicotianae； metalaxyl； fungicide resistance

2013-10-29

：2014-03-20

贵州省科学技术基金(黔科合J字[2011]2336号，黔科合J字[2012]2257号);贵州省烟草公司科技计划项目(200916，201022)

S 435.72

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.032

* 通信作者 E-mail: mengjy0417@163.com