野木瓜注射液对炎性疼痛小鼠背根神经节COX-2表达的影响*

杨燕京, 李小军, 刘力维, 郭 强, 李玉桑, 奉黎静, 唐和斌

(中南民族大学药学院药理学研究室，湖北 武汉 430074)

野木瓜为木通科(Lardizabalaceae)野木瓜属植物，拉丁学名StauntoniachinensisDC.，有强心利尿、驱虫止痛之功效[1]。野木瓜注射液(injection staun-toniae，IS)是从野木瓜中提取的有效成分，通过加工提取精制而成的一种中药注射液[2]。已有许多文献和临床试验观察表明，野木瓜注射液具有抗炎消肿和止痛作用，可用于各种术后止痛、卒中后肩痛、臀上皮神经卡压综合症等[1]。彭小莉等[3]证实野木瓜注射液能预防和缓解大鼠足底皮下化学组织损伤诱致的持续性自发痛；刘向明等[4]利用微电极细胞外记录技术，观察得出野木瓜注射液可以在外周水平上阻滞Wistar大鼠痛觉信息的传导，是其产生镇痛作用的原因之一。然而尚未见野木瓜注射液经治疗炎性疼痛反应与环氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)表达有关的研究报道。COX-2是前列腺素合成的一种诱导型限速酶，催化前列腺素合成参与炎症反应[5]。本文从疼痛行为学和细胞生物学角度出发，研究野木瓜注射液对足底慢性炎症疼痛模型小鼠背根神经节细胞内COX-2的表达干预及抗炎镇痛的作用，为其临床应用和推广提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 材料与仪器

SPF级昆明小鼠由湖北省实验动物研究中心提供，体质量20～25 g，雄性，许可证号SCXK(鄂)2008-0005；野木瓜注射液(广东和平制药，2 mL×6，含总黄酮不少于0.24 mg)；角叉菜胶(Sigma)；COX-2蛋白免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；足底测痛仪。

2 动物分组

动物的饲养环境为温度22～25 ℃，湿度30%～40%。小鼠适应性饲养5 d后，将60只小鼠随机均分为5组，每组12只：(1) 对照组；(2) 模型组；(3) 低剂量野木瓜注射液治疗组；(4) 中剂量野木瓜注射液治疗组；(5) 高剂量野木瓜注射液治疗组。所有动物实验和处理均遵照“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”[6]。

3 方法

造模开始前，分别检测各组小鼠足趾肿胀程度和热痛阈值，与各组小鼠(除对照组注射50 μL生理盐水)左后足一次性皮内注射50 μL 1%角叉菜胶，建立小鼠慢性炎性疼痛模型，造模后，即刻采取背部皮下注射方式给药，其中治疗组小鼠分别给予1.2 μL/g相应剂量的野木瓜注射液；模型组和对照组给予等剂量的注射用水。在造模后4 h、12 h、24 h和48 h检测各组小鼠足趾肿胀程度和热痛阈值，并取小鼠背根神经节进行COX-2免疫组化染色。

3.1小鼠足趾大体观察方法 足趾肿胀测量：采用

足趾容积测量仪测定小鼠足趾的肿胀体积。固定小鼠后足，在踝关节处作一标记线，将小鼠后足浸入测量仪的液体中，浸入的深度以标记线为界，然后取出小鼠足趾，记录液体的排出量，即为小鼠的足趾体积，计算小鼠造模4 h、12 h、24 h和48 h后不同时点的足趾肿胀程度。每只小鼠均重复3次实验，取3次实验结果的平均值。时点的足趾肿胀程度(%)=(时点的足趾体积-注射前足趾体积)/ 注射前足趾体积×100%。

3.2小鼠行为学测试方法 热痛阈值的测定：将小鼠放置于足底测痛仪玻璃板上的格子里，待其安静后，开启玻璃板下方的红外辐射灯照射其足底，依据记录仪器上所显示的时间，测定小鼠足底热痛阈值。每只小鼠均重复3次实验，每次至少间隔5 min，取3次实验结果的平均值。

3.3小鼠背根神经节L5 DRG细胞中COX-2的表达 断头处死小鼠后取小鼠第5腰椎(lumbar 5, L5)背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)固定并且石蜡包埋，进行COX-2蛋白的免疫组织化学染色。COX-2蛋白阳性表达时呈棕黄色片状或颗粒状，根据阳性细胞分布情况，每张切片选取3个不同的视野，采用Image-Pro Plus图像分析系统半定量计算COX-2蛋白的表达[7]。

4 统计学处理

数据采用GraphPad Prism 5.0.1科学统计绘图软件分析，数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，组间和组内比较均采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 野木瓜注射液对小鼠足趾肿胀的影响

1%角叉菜胶造模后，模型小鼠左后足均明显红肿。小鼠组织肿胀程度统计结果如图1可见，在角叉菜胶注射后，模型组小鼠的足趾肿胀程度相对于造模前持续显著升高，注射角叉菜胶后48 h，与对照组(100%±3%)相比，模型组(203%±6%)足趾肿胀明显。可见角叉菜胶皮内注射引发小鼠组织明显水肿、炎症反应。注射角叉菜胶后48 h，与模型组相比，野木瓜注射液低、中、高剂量治疗组小鼠的足趾肿胀度显著降低(171%±10%、174%±12%和171%±4%)，表明野木瓜注射液可以有效减轻角叉菜胶诱导的炎症反应。

Figure 1. Paw edema changes in the mice with different treatments.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs respective control; #P<0.05 vs model at 24 h.

2 小鼠足底热痛阈值

由图2可见，皮内注射角叉菜胶后，与对照组(16.1 s±0.6 s)相比，模型组小鼠足底热痛阈值显著降低(9.8 s±0.9 s)，在注射后4 h降到最低，表明角叉菜胶注射后，模型组小鼠对热痛的敏感性明显升高。注射角叉菜胶后48 h，相对于模型组(11.8 s±1.1 s)，野木瓜注射液低、中、高剂量治疗组小鼠的足底热痛阈值(16.7 s±4.3 s、17.5 s±0.9 s和18.8 s±1.6 s)明显升高，其中高剂量野木瓜注射液治疗组小鼠的足底热痛阈值恢复到对照组的121%。这表明，野木瓜注射液可以有效抑制角叉菜胶皮内注射引发的痛觉过敏，并且其药物作用时间持久。

Figure 2. Pain threshold changes in the mice with different treatments.Mean±SEM.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs respective control; #P<0.05 vs model at 48 h.

3 小鼠背根神经节COX-2表达

小鼠背根神经节COX-2蛋白免疫组织化学染色结果如图3。在对照组，小鼠L5 DRG细胞中无明显COX-2蛋白表达。模型组小鼠L5 DRG细胞中COX-2蛋白表达明显。治疗组经过治疗后，小鼠L5 DRG细胞中COX-2蛋白表达有所下调。在角叉菜胶注射后12 h、24 h和48 h，模型组小鼠的L5 DRG细胞中的 COX-2表达(323%±18%、324%±24%和342%±15%)较对照组(100%±23%、119%±16%和119%±10%)显著增加，见图4。而在注射角叉菜胶后48 h，低、中、高剂量野木瓜注射液治疗组小鼠L5 DRG细胞中的COX-2表达(238%±23%、225%±16%和102%±12%)较模型组显著降低，有剂量依赖性。由此我们推断，野木瓜注射液可能是通过干预背根神经节中COX-2蛋白表达来抑制炎症进而阻止疼痛的传导。

讨 论

炎性疼痛是由于创伤、外科手术以及细菌或病毒感染等引发外周组织损伤而导致的炎症反应，表现为局部的红、肿、热、痛与功能障碍，是临床常见的疾病之一[8]。在炎症的早期，某些炎症介质刺激血管，使血管扩张，血管内皮间隙扩大，血管壁通透性增强，血浆内的液体、蛋白质和白细胞等渗出到组织间隙，造成组织肿胀，因此，炎症渗出、组织肿胀是炎症早期的重要指标[9]。本研究采用的1%角叉菜胶诱导的小鼠足底疼痛模型可以有效地产生炎性应答。根据形态学结果分析，野木瓜注射液具有抗炎消肿作用。

COX-2与炎症反应、疼痛信号转导等密切相关，其在中枢和周边神经系统的蛋白表达水平因组织损伤和由此产生的炎症诱导而增加[10]。COX-2表达增加使前列腺素合成增加，后者通过激活环磷酸腺苷和蛋白激酶A通路，加强脊髓疼痛信号以及突触传递，引起外周伤害性神经末梢敏化，炎症局部出现痛觉过敏[11]。近年的研究表明，通过下调COX-2蛋白表达可阻碍P物质的合成和释放，进而产生抗炎镇痛的作用[10]。本实验中角叉菜胶处理小鼠用药治疗前后足底热痛阈值对比，显示野木瓜注射液具有良好的镇痛作用。同时，COX-2蛋白免疫组织化学染色结果显示，48 h时，治疗组各组小鼠背根神经节COX-2蛋白的表达均低于模型组，并且高剂量野木瓜注射液治疗组背根神经节COX-2蛋白的表达降低到正常水平。这些实验数据显示，野木瓜注射液可以通过干预COX-2蛋白表达，减轻角叉菜胶引起的炎症水肿，从而达到抗炎镇痛的良好效果。

Figure 3. The expression of COX-2 in the DRG of the mice with different treatments by an immunochemical method.Bar=50 μm.

Figure 4. The expression of COX-2 in the DRG of the mice with different treatments.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs respective control; #P<0.05, ##P<0.01 vs respective model.

[参 考 文 献]

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[2] 陈 素, 刘向明, 张 凡, 等. 野木瓜注射液镇痛作用的药理机制研究[J]. 中国中西医结合杂志, 2006, 26(S1):39-43.

[3] 彭小莉, 高喜玲, 陈 军, 等. 鸡矢藤注射液和野木瓜注射液对大鼠足底皮下化学组织损伤诱致自发痛、痛敏和炎症的作用[J]. 生理学报, 2003, 55(5):516-524.

[4] 刘向明, 郭学芹, 陈 素. 野木瓜注射液对大鼠外周痛觉信息传导的影响[J]. 中南民族大学学报：自然科学版, 2010, 29(1):46-50.

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