TLR2和TLR4在牛型结核分枝杆菌诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用*

林洪升， 杨海波△， 谢恺庆, 杨 利， 周静文， 周马林， 黄企光

(广西医科大学 1微生物学教研室， 2第一附属医院肾内科，广西 南宁 530021)

结核病是世界范围内严重威胁人类健康的疾病之一，在2012年全球新增感染人数约860万，死亡人数为130万。泌尿生殖系统结核作为仅次于淋巴结核的肺外结核，其中又以肾结核多见。研究表明，在受到病原微生物感染时，肾小管上皮细胞可通过释放细胞因子、募集炎症细胞启动局部炎症和免疫反应，同时肾小管上皮细胞还可以转分化成为兼职免疫细胞表达Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)，参与炎症和免疫的调控作用[1]。TLRs作为一种重要的模式识别受体，是联系先天性免疫和获得性免疫的重要蛋白[2]。在参与识别结核分枝杆菌及其衍生物和促发炎症和免疫应答过程中，又以TLR2和TLR4为主[3-4]。但是在肾结核发病过程中，结核分枝杆菌是否通过活化TLR2和TLR4途径诱导肾小管上皮细胞的损伤而参与肾小管间质炎症和纤维化过程，目前仍不清楚。因此，我们通过体外实验验证牛型结核分枝杆菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)对人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)TLR2和TLR4表达的影响，探讨BCG 刺激TLR2和TLR4活化后对HK-2细胞的损伤作用及其生物学效应。

材 料 和 方 法

1 菌株与细胞株

BCG由广西医科大学微生物教研室提供；人近端肾小管上皮细胞株HK-2购于ATCC。

2 主要试剂和仪器

DMEM/F12培养基、胎牛血清(fetal calf serum,FCS)和M7H9培养基(Dibco)；引物合成(TaKaRa)；RNeasy Mini Kit(Qiagen)；qRT-PCR试剂盒(Roche)；鼠抗人TLR2单克隆抗体(BioLegend)；鼠抗人TLR4单克隆抗体、鼠抗人趋化因子CX3CL1单克隆抗体(R&D)；鼠抗人TGF-β1单克隆抗体(Cell Signal Technology)； CO2孵育箱(Thermo Science)；RT-PCR仪(ABI)；荧光定量PCR仪器(Eppendrof)；垂直电泳-转膜装置(Bio-Rad)；其它Western bloting 相关试剂 (碧云天)；TLR4拮抗剂CLI-90(Invitrogen)。

3 方法

3.1BCG培养 BCG接种于M7H9培养基(含10% ADC营养液)中，置37 ℃培养7 d。实验前，培养物经研磨后，3 000×g离心7 min，用PBS洗涤2次。使用麦氏比浊仪，测定菌液浊度(McFarland turbidity standard,McF)，再加入无血清DMEM/F12培养液调整菌液终浓度至实验浓度(0.7 McF)。

3.2HK-2细胞培养和分组干预 HK-2细胞于37 ℃、5% CO2条件下，用含10%FCS的DMEM/F12培养基培养。HK-2细胞经含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化后，用含10%FCS的DMEM/F12培养液重悬，以每孔1×105细胞数接种于6孔板中，置37 ℃、5% CO2条件下培养，待细胞融合至70%～80%后改为无血清DMEM/F12培养24 h，使细胞同步化生长后进行实验。时间依赖效应以BCG(0.7 McF)分别刺激细胞0、2、4、6、12和24 h后收集细胞。剂量依赖效应分别用BCG(0.4、0.5和0.7 McF)刺激细胞6和12 h后收集细胞。 TLR2和TLR4阻断实验中，以LPS(50 μg/L)作为阳性对照，PBS作为阴性对照，TLR2特异性抗体(10 mg/L)孵育HK-2细胞1 h后，加入BCG(0.7 McF)刺激细胞12 h， TLR4拮抗剂CLI-90(10 mg/L)孵育HK-2细胞1 h后，加入BCG(0.7 McF)刺激细胞6 h。

3.3总RNA提取和荧光定量PCR HK-2细胞的总RNA提取按照RNeasy Mini Kit说明书进行，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA。Real-time PCR实验根据FastStart Universal SYBR Green Master说明书操作，在Mastercycler eprealplex实时荧光定量PCR仪进行反应，每组样品设3复孔。循环参数：预变性95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，收集荧光，共40个循环。溶解曲线循环参数：95 ℃ 1 min，65 ℃至95 ℃以0.1 ℃/s 进行升温。通过基于内参照GAPDH的定量分析，目的基因mRNA表达量用2-ΔΔCt计算转录水平的差异，引物序列见表1。

表1 引物序列

3.4Western blotting HK-2细胞总蛋白提取根据RIPA Lysis Buffer说明书进行，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，并以每孔50 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳。用PVDF膜在半干法转膜仪转膜。转膜结束后，用Western封闭液室温封闭1 h。去除封闭液后，加入目的蛋白特异性抗体4 ℃条件下封闭过夜。TLR2(1∶1 000)、TLR4(2 mg/L)、CX3CL1(1 mg/L)、TGF-β1(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗体经Western Ⅰ抗稀释液稀释。按照ECL超敏发光液说明书对膜孵育，最后在暗房显影。条带经扫描后，使用Quantity One软件进行灰度值分析。

4 统计学分析

应用SPSS 13.0软件处理。实验重复3次，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组内比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 BCG刺激HK-2细胞对TLR2、TLR4、CX3CL1和转化生长因子β1 (transforming growth factor β1，TGF-β1)表达的影响

用BCG(0.7 McF)刺激HK-2细胞并分别于 0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h时检测相关mRNA和蛋白表达水平。结果显示，BCG可诱导HK-2细胞TLR2、TLR4、CX3CL1和TGF-β1mRNA及蛋白表达显著上调，且呈时间依赖性。其中TLR2 mRNA和蛋白在12 h时表达最高(P<0.01)，见图1A、2A; TLR4 mRNA和蛋白在6 h时显著上调，见图1B、2B; CX3CL1 mRNA表达在6 h时达到高峰(P<0.01)，蛋白则在12 h时表达量最大(P<0.01)，见图1C、2C；TGF-β1的mRNA和蛋白表达在12 h时有明显提高(P<0.01)，见图1D、2D。

2 不同浓度BCG刺激HK-2细胞对TLR2和TLR4 mRNA和蛋白表达的影响

加入BCG(0.4、0.5和0.7 McF)分别刺激HK-2细胞6 h和12 h。结果显示，BCG刺激HK-2细胞TLR2和TLR4表达呈剂量依赖性，二者均在BCG浓度为0.7 McF时提高最显著(P<0.01)，见图3。

3 TLR2特异性抗体对BCG刺激HK-2细胞诱导CX3CL1和TGF-β1表达的影响

在加入TLR2特异性抗体封闭后，CX3CL1 mRNA和蛋白表达(图4A、C)与BCG组相比，有明显下调(P<0.05)。TGF-β1mRNA和蛋白的表达(图4B、D)在加入TLR2特异性抗体后，与BCG组相比同样有明显降低(P<0.05)。

4 TLR4拮抗剂CLI-90对BCG刺激HK-2细胞诱导CX3CL1和TGF-β1表达的影响

在加入TLR4拮抗剂封闭后，CX3CL1 mRNA和蛋白表达(图5A、C)与BCG组相比，有明显下调(P<0.05)。TGF-β1mRNA和蛋白的表达(图4B、D)在加入TLR4拮抗剂后，与BCG组相比没有明显变化。

讨 论

近年来研究表明，肾小管上皮细胞不仅是一种肾脏组织细胞，而且还具备免疫细胞的潜质。损伤活化后的肾小管上皮细胞不仅可以通过释放炎症介质、生长因子和趋化因子参与炎症反应，还可以作为兼职抗原提呈细胞激活T淋巴细胞。因此肾小管上皮细胞的慢性损伤在介导肾小管间质炎症和纤维化中扮演重要角色[5-7]。Toll样受体是一类参与先天性免疫应答的重要蛋白质分子[8]，在许多肾脏疾病中也发挥了关键的作用[9]。有报道表明，肾小管上皮细胞是肾脏中重要的TLR2和TLR4表达细胞[10]，可以与病原微生物或其衍生物相互作用，促发先天性免疫反应，通过释放各种细胞因子、趋化因子以及抗菌肽等参与到感染的炎症过程中[1]，提示在肾结核致病过程中结核分枝杆菌有可能与肾小管上皮细胞发生相互作用，通过刺激肾小管上皮细胞TLR2和TLR4表达上调，诱导细胞产生各种细胞因子，最终导致肾小管上皮细胞的损伤。本研究中，我们以卡介苗刺激HK-2细胞，初步探究TLR2和TLR4在结核杆菌引起肾小管上皮细胞损伤中的作用。

Figure 3. Effects of different concentrations of BCG on the mRNA (A,B) and protein (C,D) expression of TLR2 (A,C) and TLR4 (B,D) in HK-2 cells. HK-2 cells was treated with different concentrations (0.4, 0.5 and 0.7 McF) of BCG for 6 h or 12 h. The expression of TLR2 and TLR4 at mRNA and protein levels was evaluated by quantitative real-time PCR and Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs 0 McF.

本研究显示，HK-2细胞在加入BCG刺激后，TLR2和TLR4 mRNA和蛋白质的表达均呈时间、剂量依赖性增高(图1A、1B、2A、2B和图3)，并且TLR2在刺激12 h后，mRNA和蛋白质水平达到最高峰(P<0.01)，TLR4在刺激6 h后，mRNA和蛋白质水平达到最高(P<0.01)，实验结果与其它文献结果相似[11-12]，说明BCG可诱导HK-2细胞TLR2和TLR4表达上调。此外，在BCG刺激下，2种细胞因子CX3CL1和TGF-β1mRNA和蛋白的表达均表现为时间依赖性(图1C、1D、2C、2D)。CX3CL1在BCG刺激6 h后，mRNA水平达到最高(P<0.01)，在刺激12 h后，蛋白表达量达到最高(P<0.01)。TGF-β1mRNA和蛋白水平在BCG刺激后12 h达到高峰(P<0.01)。在慢性炎症中，趋化因子CX3CL1对于中性粒细胞和单核巨噬细胞等炎症细胞的募集迁移起重要作用，促使肾组织内炎症细胞的浸润，加重炎症反应[13]。转化生长因子TGF-β1则是一种重要的致纤维化因子，过量表达的TGF-β1将导致细胞外基质的过度产生而加重组织纤维化[14]。本实验结果提示结核杆菌可以诱导肾小管间质炎症和纤维化的发生。

Figure 4. Effects of TLR2 antibody on the mRNA (A,B) and protein (C,D) expression of CX3CL1 (A,C) and TGF-β1 (B,D) in the HK-2 cells stimulated by BCG.HK-2 cells were preincubated with TLR2 monoclonal antibody 1 h before simulated with BCG (0.7 McF) or LPS (50 μg/L) for 12 h. The mRNA and protein expression of CX3CL1 and TGF-β1 was detected by quantitative real-time PCR and Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05 vs BCG.

为了进一步明确BCG是否可通过激活HK-2细胞TLR2和TLR4来调节CX3CL1和TGF-β1的产生，我们通过TLR2特异性抗体及TLR4拮抗剂CLI-90封闭HK-2细胞TLR2和TLR4。在BCG分别刺激HK-2细胞6 h和12 h后，通过qRT-PCR方法和Western blotting方法观察CX3CL1和TGF-β1mRNA水平和蛋白水平。实验结果表明，加入TLR2特异性抗体封闭后，CX3CL1和TGF-β1mRNA和蛋白表达水平(图4A、C)与BCG组相比有明显下调(P<0.05)；加入CLI-90后，CX3CL1 mRNA和蛋白表达水平(图5A、C)与BCG组相比，有显著降低(P<0.01)，而TGF-β1未受CLI-90影响，其mRNA和蛋白表达水平(图5B、D)与BCG组差异无统计学意义(P>0.05)。以上结果提示，在BCG刺激下，CX3CL1的分泌受到TLR2和TLR4的调控，结果与Hung等[15]和Brown等[16]的结论相似。另一方面，TGF-β1的表达受到TLR2的调控，但是在加入CLI-90、BCG刺激6 h后，其mRNA和蛋白表达与BCG组并无显著差异(P>0.05)，说明TGF-β1有可能不受TLR4的调控。这些实验结果提示，结核杆菌可以通过活化TLR4或TLR2而介导肾脏炎症和纤维化过程。

Figure 5. Effects of TLR4 inhibitor CLI-90 on the mRNA (A,B) and protein (C,D) expression of CX3CL1 (A,C) and TGF-β1 (B,D) in the HK-2 cells stimulated by BCG. After exposed to CLI-90 for 1 h, the HK-2 cells were stimulated with BCG (0.7 McF) or LPS (50 μg/L) for 6 h. The mRNA and protein expression of CX3CL1 and TGF-β1 was detected by quantitative real-time PCR and Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control; #P<0.01 vs BCG.

我们的实验证明了BCG可以诱导HK-2细胞TLR2、TLR4、CX3CL1和TGF-β1表达的上调。CX3CL1表达受到TLR2和TLR4的调控，而TGF-β1表达与TLR2有关。以上结果提示，在结核分枝杆菌感染人肾小管上皮细胞时，TLR2和TLR4均可被激活。其中，TLR2和TLR4介导了炎症反应的过程，通过上调趋化因子CX3CL1的表达募集炎症细胞。此外，TLR4活化后可能通过上调TGF-β1的表达，直接参与调控肾小管间质纤维化的过程。

[参 考 文 献]

[1] 王 轩, 袁伟杰. 肾小管上皮细胞转分化类型及其在肾脏疾病进展中的作用[J]. 中国病理生理杂志, 2012, 28(10):1906-1909.

[2] Pasare C, Medzhitov R. Toll-like receptors: linking innate and adaptive immunity[J]. Microbes Infect, 2004, 6(15):1382-1387.

[3] Ho AW, Wong CK, Lam CW. Tumor necrosis factor-alpha up-regulates the expression of CCL2 and adhesion molecules of human proximal tubular epithelial cells through MAPK signaling pathways[J]. Immunobiology, 2008, 213(7):533-544.

[4] von Meyenn F, Schaefer M, Weighardt H, et al. Toll-like receptor 9 contributes to recognition ofMycobacteriumbovisBacillus Calmette-Guérin by Flt3-ligand generated dendritic cells[J]. Immunobiology, 2006, 211(6-8):557-565.

[5] Sánchez D, Rojas M, Hernández I, et al. Role of TLR2- and TLR4-mediated signaling inMycobacteriumtuberculosis-induced macrophage death[J]. Cell Immunol, 2010, 260(2):128-136.

[6] Liu Y. Renal fibrosis: new insights into the pathogenesis and therapeutics[J]. Kidney Int, 2006,69(2):213-217.

[7] Eddy AA. Progression in chronic kidney disease[J]. Adv Chronic Kidney Dis, 2005, 12(4):353-365.

[8] Kumar H, Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and innate immunity[J]. Biochem Biophy Res Commun, 2009, 388(4):621-625.

[9] Anders HJ. Signaling danger: Toll-like receptors and their potential roles in kidney disease[J]. J Am Soc Nephrol, 2004, 15(4):854-867.

[10] Wofls TG, Buurman WA, van Schadewijk A, et al.Invivoexpression of Toll-like receptor 2 and 4 by renal epithelial cells: IFN-γ and TNF-α mediated up-regulation during inflammation[J]. J Immunol, 2002, 168(3):1286-1293.

[11] Yang CW, Hung CC, Wu MS, et al. Toll-like receptor 2 mediates early inflammation by leptospiral outer membrane proteins in proximal tubule cells[J]. Kidney Int, 2006, 69(5):815-822.

[12] Li FL, Yang NS, Zhang LL, et al. Increased expression of Toll-like receptor 2 in rat diabetic nephropathy[J]. Am J Nephrol, 2010, 32(2):179-186.

[13] Charo IF, Ransohoff RM. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation[J]. New Engl J Med, 2006, 354(6):610-621.

[14] Border WA, Noble NA. TGF-beta in kidney fibrosis: a target for gene therapy[J]. Kidney Int, 1997, 51(5):1388-1396.

[15] Hung CC, Chang CT, Chen KH, et al. Upregulation of chemokine CXCL1/KC by leptospiral membrane lipoprotein preparation in renal tubule epithelial cells[J]. Kidney Int, 2006, 69(10):1814-1822.

[16] Brown HJ, Lock HR, Wolfs TG, et al. Toll-like receptor 4 ligation on intrinsic renal cells contributes to the induction of antibody-mediated glomerulonephritis via CXCL1 and CXCL2[J]. J Am Soc Nephrol, 2007, 18(6):1732-1739.