HPLC-ELSD法测定咳喘宁中桔梗皂苷D的含量

郑琰+张秀丽+崔岩

[摘要] 目的 建立高效液相色谱法测定咳喘宁中桔梗皂苷D的方法。 方法 采用以蒸发光散射检测器的高效液相色谱法，色谱柱为Kromasil C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），流动相为乙腈∶水（28∶72），流速为0.9 ml/min，ELSD漂移管温度为70℃，气体流速为3.0 SLPM/min。 结果 桔梗皂苷D进样量在0.513～10.260 μg范围内呈良好线性关系（r=0.9996），平均回收率98.44%，RSD=0.88%（n=6）。 结论 该方法准确，可靠，重复性好，灵敏度高，可用于咳喘宁的质量控制标准。

[关键词] 咳喘宁；桔梗皂苷D；高效液相色谱法-蒸发光散射检测器

[中图分类号] R286[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）05（b）-0011-03

Determination of platycodin D in Kechuanning by HPLC-ELSD method

ZHENG Yan ZHANG Xiu-li CUI Yan

Institute for Food and Drug Control of Chaoyang City in Liaoning Province,Chaoyang122000,China

[Abstract] Objective To establish a method for determination the content of platycodin D in Kechuanning. Methods High performance liquid chromatography with evaporative light scattering detector(HPLC-ELSD)method was used,the column was Kromasil C18(4.6 mm×250.0 mm,5 μm),mobile phase was acetonitrile︰water(28∶72).The flow rate was 0.9 ml/min,the ELSD drift tube temperature was 70℃ and the gas flow rate was 3.0 SLPM/min. Results The linear range of Platycodin D was 0.513-10.260 μg(r=0.9996).The average recovery was 98.44%,RSD=0.88%(n=6). Conclusion The method is accurate,reliable,good reproducibility,high sensitivity and can be used for the quality control of Kechuanning standard.

[Key words] Kechuanning;Platycodin D;HPLC-ELSD

咳喘宁收载于原卫生部药品标准中药成方制剂第二册[1]，由桔梗、石膏、罂粟壳、甘草、麻黄、百部、苦杏仁等七味药制备而成的复方制剂，具有宣肺通气、止咳平喘之功效，用于支气管哮喘、咳嗽、老年痰喘。桔梗为处方中的君药，其镇咳祛痰的作用与桔梗含量高低密切相关。桔梗含多种皂苷，以桔梗皂苷D为主，在标准中只有此药的性状及常规检查项，无任何定性及定量鉴别，故笔者参考《中国药典》[2]及其他文献中桔梗的含量测定方法，建立HPLC-ELSD测定咳喘宁中桔梗皂苷D。

1 仪器与试剂

Waters 2695型高效液相色谱仪，Waters 2424型蒸发光散射检测器，CPA225D电子分析天平（德国赛多利斯公司），9860A型超声仪（费纳米科技发展有限公司）。桔梗皂苷D对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111851-201204），咳喘宁（海南先声药业有限公司，批号：20130501、20130804、20131001），乙腈为色谱纯，水为纯净水，三氯甲烷、正丁醇、甲醇等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Waters C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（28∶72）；柱温：28℃；流量：0.9 ml/min；漂移管温度：70℃，气体流速3.0 SLPM/min。理论板数按桔梗皂苷D峰计算≥4000[3-14]。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取桔梗皂苷D对照品5.13 mg置于10 ml容量瓶中，加甲醇少量溶解并稀释刻度，作为对照品溶液，其浓度为0.513 mg/ml[2]。

2.2.2 供试品溶液的制备精称本品20片，研细，精称13片量，精密加入50%甲醇50 ml，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 ml，水浴蒸干，残渣加水20 ml，微热使溶解，加入用水饱和的正丁醇30 ml，振摇提取，再分别提取两次，20 ml/次，合并正丁醇提取液，用氨试液50 ml洗涤，弃去氨液，再用正丁醇饱和水50 ml洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇3 ml使溶解，加硅胶0.5 g拌匀，置水浴上蒸干，加于硅胶柱[100～120目，10 g，内径为2 cm，用三氯甲烷-甲醇（9∶1）（混合溶液①）混合溶液湿法装柱]上，以混合溶液①150 ml洗脱，弃去洗脱液，再用混合溶液②100 ml洗脱，弃去洗脱液，继用混合溶液②[三氯甲烷-甲醇-水（60∶20∶3）]100 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解转移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得供试品溶液[2]。按处方称取不含桔梗的其他药材，制备阴性样品，按2.2.2制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 阴性干扰实验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，在上述色谱条件下测定，结果见图1。该色谱条件下桔梗皂苷D峰形良好，阴性对照图谱显示在此处无干扰，表明其他成分对测定无干扰。

图1 咳喘宁HPLC色谱图

A.对照品（桔梗皂苷D）；B.供试品；C.阴性对照

2.3.2 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，回归方程Y=30205.9X+19474.1（r=0.9996），表明桔梗皂苷D对照品进样量在0.513～10.260 μg范围内有良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验精密吸取对照品溶液10 μl，重复进样6次，按峰面积记录色谱图，RSD=0.34%（n=6），结果提示仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验取同一批号（批号为20130501）样品6份，依法处理后分别测定，RSD=0.98%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验取同一供试品溶液（批号为2013 0501）10 μl，按上述色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h测定，以峰面积计算，RSD=0.85%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.6 加样回收率试验精密称取己知含量的供试品（批号20130501，桔梗皂苷D含量为0.1223 mg/g）6份，每份3.2 g，精密加入定量的桔梗皂苷D对照品溶液，按供试品溶液方法制备，依法测定含量并计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.4 样品含量测定

取3批样品，按供试品溶液方法制备，分别进样10 μl，依法测定，采用外标两点法计算样品中桔梗皂苷D的含量，结果见表2。

表2 样品中桔梗皂苷D的测定结果（n=5）

3 讨论

3.1 关于桔梗皂苷D

现代研究表明，桔梗中所含化学成分主要为五环三萜类的多糖苷，包括桔梗皂苷A、C、D、D2、D3，而桔梗皂苷D是桔梗皂苷中的主要皂苷。药效学试验表明，桔梗皂苷D具有显著镇咳、祛痰作用，与桔梗主治功效相符[15-16]。

3.2 紫外法分析

桔梗的活性成分桔梗皂苷D只有1个C=C双键，在紫外处几乎无吸收，所以本文采用HPLC-ELSD法对其进行定量分析。

3.3 流动相的选择

参考《中国药典》2010年版中桔梗皂苷D的色谱条件，分别考察了乙腈-水，甲醇-水系统，结果发现乙腈-水系统有较好的色谱峰形及分离度，最终选定了乙腈-水（28∶72）这个比例。

3.4 检测器条件的研究

研究发现，载气流速和漂移管的温度对ELSD的检测性有较大影响。ELSD漂移管温度设为50℃时，色谱峰峰形不对称且基线噪声偏大，将温度调高至70℃时，有了较好的色谱峰形且基线噪声变小，故最终选定漂移管温度为70℃，气体流速为3.0 SLPM/min。

[参考文献]

[1]卫生部.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第二册[M].北京：中国医药科技出版社，1986：163.

[2]国家药典委员会.中国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：259.

[3]李红燕，张蕊，冯晓川.HPLC-ELSD法测定复方枇杷止咳颗粒中桔梗皂苷D、熊果酸、齐墩果酸和贝母素甲[J].中成药，2013，35（7）：1479-1486.

[4]彭善贵，文永盛.高效液相色谱法-蒸发光散射检测器法测定甘桔冰梅片中桔梗皂苷D含量[J].中国药业，2012， 21（19）：28-29.

[5]丁大勇，高菲，姚琳，等.HPLC-ELSD法测定桑菊感冒片的含量中桔梗皂苷D[J].中国中医药信息杂志，2012，19（3）：54-55.

[6]笔雪艳，刘晓风，张清波，等.桔梗药材及饮片的质量标准研究[J].中医药信息，2011，28（6）：69-71.

[7]姚琳，孙妍，谭思思，等.瓜桔止嗽丸薄层鉴别及桔梗皂苷D的含量测定[J].中华中医药学刊，2013，31（7）：1703-1705.

[8]张晶，李伟，王梓，等.RP-HPLC法测定桔梗地上部分桔梗皂苷D的含量[J].药物分析杂志，2008，28（9）：1497-1499.

[9]李伟，王梓，刘志，等.RP-HPLC同时测定桔梗中去芹糖桔梗皂苷D与桔梗皂苷D[J].中草药，2009，40（11），1823-1825.

[10]龙芳.RP-HPLC-ELSD法测定贝杏止咳膏中桔梗皂苷D的含量.[J].中医药导报，2011，17（10）：68-70.

[11]夏泉，董婷霞，詹华强，等.HPLC-ELSD法测定不同来源桔梗中桔梗皂苷E的含量[J].药物分析杂志，2006， 26（5）：637-639.

[12]叶静，肖美添，汤须崇，等.HPLC-ELSD法测定桔梗中3种桔梗皂苷的含量[J].西安交通大学学报·医学版，2010，31（5）：640-642.

[13]杨壮.桔梗总皂苷的提取和纯化工艺研究[D].杭州：浙江大学药学院，2007.

[14]朱丹妮，舒娈，郅慧，等.HPLC-ELSD法测定桔梗阻中桔梗皂苷D的含量[J].植物资源与环境学报，2001，10（4）：11-13.

[15]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，2006：1552-1555.

[16]肖培根.新编中药志[M].北京：化学工业出版社，2007：797-802.

（收稿日期：2014-03-25本文编辑：李亚聪）

2.3.6 加样回收率试验精密称取己知含量的供试品（批号20130501，桔梗皂苷D含量为0.1223 mg/g）6份，每份3.2 g，精密加入定量的桔梗皂苷D对照品溶液，按供试品溶液方法制备，依法测定含量并计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.4 样品含量测定

取3批样品，按供试品溶液方法制备，分别进样10 μl，依法测定，采用外标两点法计算样品中桔梗皂苷D的含量，结果见表2。

表2 样品中桔梗皂苷D的测定结果（n=5）

3 讨论

3.1 关于桔梗皂苷D

现代研究表明，桔梗中所含化学成分主要为五环三萜类的多糖苷，包括桔梗皂苷A、C、D、D2、D3，而桔梗皂苷D是桔梗皂苷中的主要皂苷。药效学试验表明，桔梗皂苷D具有显著镇咳、祛痰作用，与桔梗主治功效相符[15-16]。

3.2 紫外法分析

桔梗的活性成分桔梗皂苷D只有1个C=C双键，在紫外处几乎无吸收，所以本文采用HPLC-ELSD法对其进行定量分析。

3.3 流动相的选择

参考《中国药典》2010年版中桔梗皂苷D的色谱条件，分别考察了乙腈-水，甲醇-水系统，结果发现乙腈-水系统有较好的色谱峰形及分离度，最终选定了乙腈-水（28∶72）这个比例。

3.4 检测器条件的研究

研究发现，载气流速和漂移管的温度对ELSD的检测性有较大影响。ELSD漂移管温度设为50℃时，色谱峰峰形不对称且基线噪声偏大，将温度调高至70℃时，有了较好的色谱峰形且基线噪声变小，故最终选定漂移管温度为70℃，气体流速为3.0 SLPM/min。

[参考文献]

[1]卫生部.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第二册[M].北京：中国医药科技出版社，1986：163.

[2]国家药典委员会.中国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：259.

[3]李红燕，张蕊，冯晓川.HPLC-ELSD法测定复方枇杷止咳颗粒中桔梗皂苷D、熊果酸、齐墩果酸和贝母素甲[J].中成药，2013，35（7）：1479-1486.

[4]彭善贵，文永盛.高效液相色谱法-蒸发光散射检测器法测定甘桔冰梅片中桔梗皂苷D含量[J].中国药业，2012， 21（19）：28-29.

[5]丁大勇，高菲，姚琳，等.HPLC-ELSD法测定桑菊感冒片的含量中桔梗皂苷D[J].中国中医药信息杂志，2012，19（3）：54-55.

[6]笔雪艳，刘晓风，张清波，等.桔梗药材及饮片的质量标准研究[J].中医药信息，2011，28（6）：69-71.

[7]姚琳，孙妍，谭思思，等.瓜桔止嗽丸薄层鉴别及桔梗皂苷D的含量测定[J].中华中医药学刊，2013，31（7）：1703-1705.

[8]张晶，李伟，王梓，等.RP-HPLC法测定桔梗地上部分桔梗皂苷D的含量[J].药物分析杂志，2008，28（9）：1497-1499.

[9]李伟，王梓，刘志，等.RP-HPLC同时测定桔梗中去芹糖桔梗皂苷D与桔梗皂苷D[J].中草药，2009，40（11），1823-1825.

[10]龙芳.RP-HPLC-ELSD法测定贝杏止咳膏中桔梗皂苷D的含量.[J].中医药导报，2011，17（10）：68-70.

[11]夏泉，董婷霞，詹华强，等.HPLC-ELSD法测定不同来源桔梗中桔梗皂苷E的含量[J].药物分析杂志，2006， 26（5）：637-639.

[12]叶静，肖美添，汤须崇，等.HPLC-ELSD法测定桔梗中3种桔梗皂苷的含量[J].西安交通大学学报·医学版，2010，31（5）：640-642.

[13]杨壮.桔梗总皂苷的提取和纯化工艺研究[D].杭州：浙江大学药学院，2007.

[14]朱丹妮，舒娈，郅慧，等.HPLC-ELSD法测定桔梗阻中桔梗皂苷D的含量[J].植物资源与环境学报，2001，10（4）：11-13.

[15]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，2006：1552-1555.

[16]肖培根.新编中药志[M].北京：化学工业出版社，2007：797-802.

（收稿日期：2014-03-25本文编辑：李亚聪）

2.3.6 加样回收率试验精密称取己知含量的供试品（批号20130501，桔梗皂苷D含量为0.1223 mg/g）6份，每份3.2 g，精密加入定量的桔梗皂苷D对照品溶液，按供试品溶液方法制备，依法测定含量并计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.4 样品含量测定

取3批样品，按供试品溶液方法制备，分别进样10 μl，依法测定，采用外标两点法计算样品中桔梗皂苷D的含量，结果见表2。

表2 样品中桔梗皂苷D的测定结果（n=5）

3 讨论

3.1 关于桔梗皂苷D

现代研究表明，桔梗中所含化学成分主要为五环三萜类的多糖苷，包括桔梗皂苷A、C、D、D2、D3，而桔梗皂苷D是桔梗皂苷中的主要皂苷。药效学试验表明，桔梗皂苷D具有显著镇咳、祛痰作用，与桔梗主治功效相符[15-16]。

3.2 紫外法分析

桔梗的活性成分桔梗皂苷D只有1个C=C双键，在紫外处几乎无吸收，所以本文采用HPLC-ELSD法对其进行定量分析。

3.3 流动相的选择

参考《中国药典》2010年版中桔梗皂苷D的色谱条件，分别考察了乙腈-水，甲醇-水系统，结果发现乙腈-水系统有较好的色谱峰形及分离度，最终选定了乙腈-水（28∶72）这个比例。

3.4 检测器条件的研究

研究发现，载气流速和漂移管的温度对ELSD的检测性有较大影响。ELSD漂移管温度设为50℃时，色谱峰峰形不对称且基线噪声偏大，将温度调高至70℃时，有了较好的色谱峰形且基线噪声变小，故最终选定漂移管温度为70℃，气体流速为3.0 SLPM/min。

[参考文献]

[1]卫生部.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第二册[M].北京：中国医药科技出版社，1986：163.

[2]国家药典委员会.中国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：259.

[3]李红燕，张蕊，冯晓川.HPLC-ELSD法测定复方枇杷止咳颗粒中桔梗皂苷D、熊果酸、齐墩果酸和贝母素甲[J].中成药，2013，35（7）：1479-1486.

[4]彭善贵，文永盛.高效液相色谱法-蒸发光散射检测器法测定甘桔冰梅片中桔梗皂苷D含量[J].中国药业，2012， 21（19）：28-29.

[5]丁大勇，高菲，姚琳，等.HPLC-ELSD法测定桑菊感冒片的含量中桔梗皂苷D[J].中国中医药信息杂志，2012，19（3）：54-55.

[6]笔雪艳，刘晓风，张清波，等.桔梗药材及饮片的质量标准研究[J].中医药信息，2011，28（6）：69-71.

[7]姚琳，孙妍，谭思思，等.瓜桔止嗽丸薄层鉴别及桔梗皂苷D的含量测定[J].中华中医药学刊，2013，31（7）：1703-1705.

[8]张晶，李伟，王梓，等.RP-HPLC法测定桔梗地上部分桔梗皂苷D的含量[J].药物分析杂志，2008，28（9）：1497-1499.

[9]李伟，王梓，刘志，等.RP-HPLC同时测定桔梗中去芹糖桔梗皂苷D与桔梗皂苷D[J].中草药，2009，40（11），1823-1825.

[10]龙芳.RP-HPLC-ELSD法测定贝杏止咳膏中桔梗皂苷D的含量.[J].中医药导报，2011，17（10）：68-70.

[11]夏泉，董婷霞，詹华强，等.HPLC-ELSD法测定不同来源桔梗中桔梗皂苷E的含量[J].药物分析杂志，2006， 26（5）：637-639.

[12]叶静，肖美添，汤须崇，等.HPLC-ELSD法测定桔梗中3种桔梗皂苷的含量[J].西安交通大学学报·医学版，2010，31（5）：640-642.

[13]杨壮.桔梗总皂苷的提取和纯化工艺研究[D].杭州：浙江大学药学院，2007.

[14]朱丹妮，舒娈，郅慧，等.HPLC-ELSD法测定桔梗阻中桔梗皂苷D的含量[J].植物资源与环境学报，2001，10（4）：11-13.

[15]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，2006：1552-1555.

[16]肖培根.新编中药志[M].北京：化学工业出版社，2007：797-802.

（收稿日期：2014-03-25本文编辑：李亚聪）