高亮,邰宁正
(江苏大学附属医院烧伤整形科,江苏镇江212001)
外源性一氧化碳释放分子对大鼠随意窄蒂皮瓣缺血 再灌注损伤的保护作用
高亮,邰宁正
(江苏大学附属医院烧伤整形科,江苏镇江212001)
目的:观察外源性一氧化碳释放分子(CO-releasingmolecule-2,CORM-2)在皮瓣缺血再灌注损伤(ischemiareperfusion injury,IRI)过程中发挥的作用。方法:将大鼠随机分为CORM-2组和对照组,每组各18只,设计随意窄蒂皮瓣IRI模型,术后即刻尾静脉注射CORM-2(8 mg/kg);对照组:尾静脉注射等量的生理盐水。两组每隔24 h给药1次,直到术后第7天。术后24 h检测两组大鼠皮瓣组织匀浆液NF-κB活性;术后第3、5、7天分别检测上述两组皮瓣组织中丙二醛含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;大鼠心脏取血,检测血清IL-6和TNF-α水平;术后第3、5、7天对两组皮瓣蒂部进行组织学检查;拍照记录并计算术后第7天两组皮瓣的成活率。结果:①皮瓣术后第3、5、7天,与对照组比较,CORM-2组皮瓣组织中丙二醛含量明显下降(P<0.01),SOD活性明显升高(P<0.01)。②皮瓣术后第3、5、7天,CORM-2组血清中IL-6和TNF-α水平明显降低(P<0.01)。③术后24 h CORM-2组NF-κB活性明显降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。④组织学检查发现CORM-2能明显促进皮瓣蒂部组织毛细血管增生。⑤皮瓣术后第7天,CORM-2组皮瓣成活率明显高于对照组(P<0.01)。结论:CORM-2可有效降低大鼠窄蒂皮瓣的IRI,明显提高了皮瓣成活率。
CORM-2;窄蒂皮瓣;缺血再灌注损伤;丙二醛;超氧化物歧化酶;白介素-6;肿瘤坏死因子-α;NF-κB
狭长窄蒂皮瓣属于一种特殊的随意型皮瓣[1],本质上是由一个类似狭长皮瓣的蒂部(同样不包含知名血管)携带一个具有一定长宽比的皮瓣所构成的随意型皮瓣。研究证明一定长宽比的狭长窄蒂所能携带的任意皮瓣成活面积有其最大值,超过该值后皮瓣远端会发生坏死[2-3]。导致坏死的根本原因是超范围的皮瓣在术后存在缺血 再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)及因IRI引发的一系列炎症和氧化应激反应。近年来国内外的多种实验研究显示外源性一氧化碳释放分子(CO-releasing molecule-2,CORM-2)在IRI[4]、脓毒症引起的氧化应激反应[5]等病理生理过程中发挥重要的生理作用,且具有明显的抗炎作用[6]。但有关CORM-2在皮瓣中的应用研究还未见报道。本研究构建大鼠合适比例随意型窄蒂皮瓣IRI模型,利用CORM-2进行干预,观察CORM-2对皮瓣存活的影响,探讨CORM-2在窄蒂皮瓣IRI过程中所发挥的作用。
1.1 动物及分组
健康成年SD大鼠36只,雌雄不限,体质量(250±19)g,由江苏大学实验动物中心提供。随机将大鼠分为CORM-2组和对照组,每组18只。单笼饲养,自由进食饮水,室温控制在25℃左右,湿度40%~60%。
1.2 皮瓣IRI模型制备
术前1 d,8%Na2S溶液脱毛,备皮范围4~10 cm,实验前一夜禁食。腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉,大鼠俯卧位固定。将蒂设计在模型尾侧,蒂长宽为1.5 cm×1 cm,瓣长宽为6 cm×1.5 cm,手术达深筋膜,掀起皮瓣组织后,在皮瓣基底铺一次性洁净无菌保鲜膜,3-0手术缝合线原位缝合。
1.3 给药方法
CORM-2组:术后即刻尾静脉注射CORM-2(8 mg/kg);对照组:尾静脉注射等量的生理盐水。两组每隔24 h给药1次,直到术后第7天。
1.4 观察指标
1.4.1 皮瓣组织NF-κB活性的检测 术后24 h取大鼠皮瓣中部组织,按照组织匀浆方法进行匀浆和离心,提取核蛋白,采用蛋白印迹法检测NF-κB的活性。试剂为兔NF-κB p65多抗(美国Santa Cruz公司)。
1.4.2 皮瓣组织丙二醛含量和SOD活性检测 术后第3、5、7天分别取CORM-2组和对照组皮瓣中部组织,匀浆取上清液,根据1∶4比例用生理盐水进行稀释,得到2%的组织匀浆。应用硫代巴比妥酸法检测皮瓣组织丙二醛的含量,应用黄嘌呤氧化酶法检测SOD的活性。
1.4.3 血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-6水平的测定 术后第3、5、7天从大鼠心脏取血,采用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)检测血清TNF-α和IL-6含量,具体步骤参考ELISA试剂盒(南京建成生物技术公司)说明书。
1.4.4 组织学观察 术后第3、5、7天分别取CORM-2组和对照组皮瓣的蒂部0.5 cm×0.2 cm全厚皮瓣组织,以4%低聚甲醛固定,石蜡包埋切片、HE染色。
1.4.5 皮瓣成活率 术后第7天采用高清数码相机对皮瓣存活情况进行拍照,图像输入计算机,用Image-Pro P1us 7.0图像分析软件分析,并计算成活率。成活率=存活面积/皮瓣总面积×100%。
1.5 统计学处理
采用SPSS 16.0软件进行分析。两组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 皮瓣组织NF-κB活性
蛋白质印迹检测结果显示,对照组大鼠皮瓣组织中NF-κB与β-肌动蛋白的比值为1.2±0.14;尾静脉注射CORM-2干预后,大鼠皮瓣组织中NF-κB与β-肌动蛋白的比值为0.5±0.07,明显低于对照组(t=6.083,P<0.01)。见图1。
图1 两组大鼠皮瓣组织中NF-κB的表达
2.2 皮瓣组织丙二醛含量、SOD活性
与对照组比较,在第3、第5、第7天各时间点CORM-2组大鼠皮瓣组织丙二醛含量明显下降(P<0.01),而SOD活性明显升高(P<0.01)。见表1。
表1 两组大鼠皮瓣组织各时间点SOD活性和丙二醛含量的比较 ±s,n=18
表1 两组大鼠皮瓣组织各时间点SOD活性和丙二醛含量的比较 ±s,n=18
分组 SOD(nmol/kg ) 丙二醛(nmol/kg )第3天 第5天 第7天 第3天 第5天 第7天7 4.67±0.64 2.99±0.72 CORM-2组 56.93±3.70 47.22±6.32 72.72±2.28 4.15±0.36 3.47±0.36 2.25±0.16 t值对照组 44.89±3.51 33.20±5.40 53.73±11.74 5.90±0.2 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 7.952 6.269 6.012 6.369 7.698 6.874 P值
2.3 血清IL-6和TNF-α含量的变化
与对照组比较,CORM-2组大鼠各时间点血清TNF-α和IL-6含量均明显降低(P<0.01)。见表2。
表2 两组大鼠各时间点血清IL-6和TNF-α含量的变化 ±s,n=18
表2 两组大鼠各时间点血清IL-6和TNF-α含量的变化 ±s,n=18
分组 IL-6(nmol/kg )TNF-α(nmol/kg )第3天 第5天 第7天 第3天 第5天 第7天64.56±3.92 144.62±3.87 CORM-2组 0.84±0.08 0.62±0.07 0.57±0.04 140.77±3.36 111.80±4.96 99.10±5.74 t值对照组 1.05±0.09 0.94±0.09 0.89±0.07 189.84±5.68 1 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 7.063 7.986 6.996 10.95 11.58 9.698 P值
2.4 皮瓣组织的病理形态
术后第3天,CORM-2组大鼠皮瓣蒂部未见明显变化,无明显肿胀,可见少许新生毛细血管;对照组皮瓣蒂部表皮下组织略微水肿,可见中性粒细胞浸润,毛细血管增生不明显。术后第5天,CORM-2组大鼠皮瓣蒂部新生毛细血管数量明显增多;对照组皮瓣蒂部水肿不明显,可见少量中性粒细胞浸润,未见明显的毛细血管增生。术后第7天,CORM-2组可见丰富的毛细血管增生,明显多于对照组,且可见少数血管管径变大,蒂部充血。见图2。
图2 两组大鼠术后不同时间的皮瓣组织病理形态(HE染色×200)
2.5 皮瓣存活率
术后第7天,记录CORM-2和对照组各自大鼠皮瓣的成活情况。结果显示,对照组皮瓣平均存活率为52.72%,CORM-2组皮瓣平均存活率为77.22%,CORM-2组平均存活率较对照组提高24.50%,两组间差异有统计学意义(t=7.062,P<0.01)。
3.1 窄蒂皮瓣IRI模型的选择
大鼠容易饲养且手术操作和术后处理较为简单,因此常作为皮瓣实验研究的动物模型。根据王法刚等[7]对大鼠背部血流分布和实验研究分析,我们选择大鼠背部的中心线为皮瓣的轴线,将蒂部放在尾侧的皮瓣模型更稳定可靠。赵天兰等[2-3]证实,一定长宽比的狭长窄蒂所能携带的任意皮瓣成活面积有其最大值,超过限制范围,皮瓣远端即会存在血运障碍。故本实验模型采用大鼠背部中心线作为皮瓣轴线,窄蒂位于尾侧;选择的蒂长宽比为1.5 cm∶1 cm,瓣长宽比为6 cm∶1.5 cm,缺血随意皮瓣模型稳定。
3.2 CORM-2对大鼠随意窄蒂皮瓣IRI的保护作用
3.2.1 CORM-2能改善皮瓣蒂部血供 随意窄蒂皮瓣术后,首先对皮瓣成活造成最大影响的就是血供。研究显示皮瓣成活的长度与皮瓣内的血流灌注压密切相关[8]。由于本实验是通过创底铺置保鲜膜干预创底创缘的血供,因此蒂部的血供改善在皮瓣的成活过程中尤为关键。我们在术后第3、5、7天取皮瓣蒂部组织切片进行HE染色,光镜下发现CORM-2组皮瓣蒂部肉芽组织开始增生,新生毛细血管明显,且可见少数血管管径变大,蒂部充血量丰富。对照组较CORM-2组毛细血管数量少,少数亦表现出轻微玻璃样坏死。同时,我们在切取蒂部组织时发现CORM-2组蒂部切开时有明显出血,色泽鲜艳。而对照组只有少数样本出血,且出血量明显少于CORM-2组。这一现象与光镜下结果相符。在术后第7天,经图像分析数码相机记录的两组皮瓣成活情况,显示CORM-2组平均存活率较对照组明显提高。
结果证明CORM-2在随意窄蒂皮瓣缺血损伤过程中参与皮瓣血管形成、血管扩张、血液循环调节,增加蒂部血流,提高皮瓣内血流灌注压,血液走行路径得到延长、分布面积扩大,从而改变了皮瓣远端血供状况,缩小远端坏死比例,使皮瓣的成活率得到明显提高。
3.2.2 CORM-2具有抗氧化应激反应的作用 郭树忠等[9]的研究表明,随意皮瓣手术后缺血 再灌注时,皮瓣组织产生大量的自由基,进而对皮瓣造成损伤,并发现皮瓣组织中的SOD活性和丙二醛含量之间存在负相关。在皮瓣IRI过程中,自由基生成逐渐增加,从而导致丙二醛含量随之增加。由于生成的自由基对SOD有攻击性,致SOD的活性下降,导致组织内的自由基不能得到有效清除。而自由基的堆积会放大脂质过氧化反应,使丙二醛含量进一步升高,从而形成了一种恶性循环。SOD失活即意味着其对皮瓣组织的保护作用丧失。通过局部进行外源性SOD灌注能明显提高皮瓣的成活率。由此表明,SOD对皮瓣组织在缺血再灌注时所产生的大量自由基的清除是至关重要的。杜佳梅等[10]以及周力纯等[11]的研究也证实了皮瓣术后组织自由基明显增多,氧化应激反应程度升高,且对皮瓣的成活情况有明显影响。
我们在术后第3、5、7天分别取CORM-2组和对照组皮瓣中部组织进行匀浆,检测组织中抗氧化酶SOD和脂质过氧化产物丙二醛,以明确反映机体在术后抗氧化能力及氧化应激程度,从而间接反映两组皮瓣损伤程度的区别。实验结果显示,与对照组比较,CORM-2组大鼠皮瓣中的丙二醛含量明显降低,而SOD活性显著升高,表明CORM-2在窄蒂皮瓣术后能有效对抗缺血 再灌注时产生的氧化应激,减轻自由基对皮瓣的损伤,因此对皮瓣具有保护作用。
3.2.3 CORM-2的抗炎症反应作用 大量研究表明,再灌注时炎症的激发和级联反应促进了继发性损害,这是皮瓣缺血坏死的又一重要原因。TNF-α是机体内一种重要的促炎症细胞因子,IL-6是机体对感染和组织损伤所引起反应的主要介质。创伤后巨噬细胞分泌大量TNF-α和IL-6,参与机体炎症反应。国内外相关研究表明,在创伤等应激状态下,机体TNF-α和IL-6水平明显升高[12-13],导致多种炎症因子瀑布式释放,造成血管内皮功能障碍。
细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达量在缺血损伤时明显上调,再灌注时白细胞表面的整合素与其结合,导致血管内皮细胞表面大量的白细胞黏附聚集,释放一系列的炎症因子和自由基,损伤血管内皮,加重IRI[14-15]。研究显示NF-κB是一种信号传导途径中的核内反应信号分子,可诱导细胞因子、内皮细胞黏附分子、单核细胞趋化因子的转录合成,促进炎性信号的级联扩大,最终导致机体的多器官损伤。大鼠皮瓣在掀起后,就产生了缺血 再灌注损伤,机体相应释放大量的炎症介质,产生一系列炎症反应,从而造成对皮瓣组织的直接损害。实验结果显示术后24 h CORM-2组皮瓣组织NF-κB表达明显降低,且术后第3、5、7天TNF-α和IL-6血清水平明显降低(P<0.01),说明CORM-2在大鼠窄蒂皮瓣IRI模型中对炎症反应起到重要的抑制作用,可减轻IRI对皮瓣组织的损伤。本课题组前期在脓毒症实验研究中证实CORM-2具有抑制NF-κB活性和内皮细胞ICAM-1表达的作用[16]。因此,我们推测CORM-2在大鼠皮瓣IRI过程中发挥了同样的调控作用,抑制NF-κB的表达与活化,继而下调内皮细胞ICAM-1的表达,有效减少炎症因子的释放,降低炎症反应对组织的损伤;抑制中性粒细胞、血小板在血管内皮上的黏附聚集,并减少自由基的释放,对血管内皮起到一定的保护作用,促进皮瓣组织的成活。
综上所述,在大鼠皮瓣IRI中,CORM-2释放的CO作为一种血管调节因子,具有扩张血管、促进新生毛细血管形成、增加血供的作用;CO可明显抑制NF-κB活性,减少前炎症细胞因子的释放,减轻白细胞对组织和血管内皮的浸润黏附,对血管内皮起到间接保护作用;CO在产生抗炎反应的同时,减少了炎性细胞释放自由基,进而避免了IRI过程中脂质过氧化反应的放大,对组织起到保护作用。
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Protection of CO-releasing molecules-2 against the random narrow pedicle skin flap w ith ischem ia-reperfusion injury in rats
GAO Liang,TAINing-zheng
(Department of Burns and Plastic Surgery,the Affiliated Hospital of Jiangsu University,Zhenjiang Jiangsu 212001,China)
Objective:To observe the effect of CO-releasingmolecules-2(CORM-2)on the random narrow pedicle skin flap in the SD ratswith ischemia-reperfusion injury(IRI),and discuss the possiblemechanism.M ethods:Established IRImodels of random narrow pedicle skin flap in rats.A total of 36 SD rats were divided into two groups at random:CORM-2 group,models of random narrow pedicle skin flap and treated by CORM-2;NS group,models of random narrow pedicle skin flap and treated by normal saline(NS).Test the activity of NF-κB byWestern blotting.The content ofmalonaldehyde(MDA)in tissue of skin flap was detected by phenobarbitone acid;the activity of superoxide dismutase(SOD)in tissue of skin flap was detected by xanthine oxidase;the level of IL-6 and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in blood serum was detected by ELISA;pathological changes were observed with lightmicroscope in the 3rd,5th,7th day after operation;survival rate of skin flap was the average survival length of skin flap deciding practical length of skin flap.Results:①The skin flap uncovered by the 3rd,5th,7th day,compared with NSgroup,the content of MDA in the skin flap of CORM-2 group lower(P<0.01),the activity of SOD significantly increased(P<0.01).②The skin flap uncovered by 3rd,5th,7th day,compared with NS group,the level of IL-6 and TNF-αin blood serum lower(P<0.01).③Histopathology showed that abundant capillary were no-ticed by application of CORM-2.④CORM-2 can effectively restrain the NF-κB activation in random narrow pedicle skin flap model.⑤The skin flap was uncovered by the 7th day,compared with NSgroup,survival rate of skin flap of CORM-2 group significantly higher(P<0.01).Conclusion:CORM-2 effectively reduced the narrow pedicle skin flap of ratswith IRI,and improved the survival rate of flap.
CO-releasing molecule-2;random narrow pedicle skin flap;ischemia reperfusion injury;malonaldehyde;superoxide dismutase;IL-6;tumor necrosis factor-α;NF-κB
R965.1
A
1671-7783(2014)04-0307-05
10.13312/j.issn.1671-7783.y140034
国家自然科学基金资助项目(30772256,81272148)
高亮(1988—),男,硕士研究生;邰宁正(通讯作者),副主任医师,硕士生导师,E-mail:710204914@qq.com
2014-01-21 [编辑]陈海林