大孔树脂分离沙棘叶总黄酮工艺的研究

杨宏志，王瑞峰

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

沙棘又名黑刺、黄酸刺，是胡颓子科沙棘属的灌木亚乔木[1]。沙棘是药食两用植物，其中富含大量的营养物质及生物活性物质，主要有多糖类、黄酮类、有机酸、氨基酸及微量元素等[2]。沙棘中的黄酮物质主要集中在沙棘叶中，其具有抗衰老、清除体内自由基、增强免疫、抗疲劳等生理功能[3]。近年来，关于沙棘叶总黄酮的利用和研究收到广泛的关注，其应用范围也越来越广，如保健品、饮料、药品等[4]。

大孔树脂又称全多孔树脂，具有空间立体多空的结构，吸附能力较强，能够吸附许多芳香族物质，还具有选择性强、操作简单、再生方便、稳定性好等优点，现已被应用植物中生物活性成分的分离纯化，如生物碱、内酯、总黄酮等化合物[5]。目前有关大孔树脂分离沙棘叶总黄酮的研究较少，本实验主要研究D101、XAD-7PH、D3520、NKA-9、X-5、D4020、AB-87七种大孔树脂对沙棘叶总黄酮的吸附与解析特性，选出最佳树脂，以期为沙棘叶总黄酮开发利用提供科学依据，为沙棘叶总黄酮的工业化生产提供理论参考。

1 试验材料与仪器

1.1 试验材料

沙棘叶总黄酮粗提液，来自黑龙江八一农垦大学食品学院，芦丁标品，纯度为98.5%，成都邦成生物工程公司，乙醇、亚硝酸钠、甲醇、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯，D101、XAD-7PH、D3520、NKA-9、X-5、D4020、AB-8 等树脂均购自南开大学化工厂。

1.2 试验仪器

T6 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司、HL-2B 数显恒流泵购自上海市精科仪器公司；SG2 型pH 计，日本岛津；BS-100A 数控计滴自动部分收集器，北京中胜仪器设备有限公司；色谱柱Ф1.6×20 cm，色谱柱Ф2.0×30 cm 均来自北京飞美斯公司。

2 试验方法

2.1 大孔吸附树脂的预处理

刚出厂的树脂中含有防腐剂、分散剂等杂质，故因此在使用前必须要经过除杂处理。将树脂在水中浸泡24 h，使其充分溶胀[6]。之后将其置于无水乙醇中浸泡24 h，用蒸馏水冲洗至无乙醇味；采用湿法进行树脂装柱，之后用无水乙醇将树脂所含的杂质冲洗干净，再用去离子水将剩余的乙醇冲洗干净；使用5%盐酸清洗树脂柱，使其以2 BV·h-1流速流过树脂；再使用5%的氢氧化钠清洗树脂柱，流速为2 BV·h-1，并将清洗好的树脂置于真空干燥箱中，进行干燥处理（约40 ℃），之后置于干燥器中备用[7]。

2.2 样品液的预处理

将使用适当浓度的乙醇对沙棘叶中总黄酮进行提取，制成澄清的上清液，可以避免杂质染堵塞树脂，不但能够提高纯化率，还可以延长树脂的使用时间。样品液中所含沙棘叶总黄酮的浓度为10.51 mg·mL-1。

2.3 总黄酮含量的测定方法

准确称取2.000 1 g 在105 ℃条件下干燥的芦丁标准品，添加甲醇并置于水浴锅中加热，使其溶解，待温度降到室温后，加入甲醇定容至100 mL。分别准确量取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 和5.0 mL置于10 mL 的容量瓶中，再分别加入1 mL 浓度为5%的三氯化铝甲醇溶液，6 mL 蒸馏水并加入甲醇定容至10 mL。之后在430 nm 波长下对其进行吸光度测定[8]。芦丁标准品浓度C 为横坐标，吸光度值A 为纵坐标，绘制标准曲线图如图1 所示：

用最小二乘法进行线性回归，得回归方程：

此方程的相关系数r=0.999 6。

图1 芦丁标准曲线图Fig.1 The standard curve of aloes

此式中：C－样品浓度（mg·mL-1）；

A－吸光度值；

R－回归系数。

根据标准曲线计算提取液中总黄酮的浓度C，然后可以计算出沙棘叶中总黄酮提取的得率。公式如下：

2.4 大孔树脂的初步筛选

试验选取7 种适合分离沙棘叶总黄酮的大孔吸附树脂，从中选出最优树脂用于分离总黄酮。

2.4.1 树脂的静态吸附量测定

准确称取7 种经预处理的干树脂D101、X-5、NKA-9、AB-8、D4020、D3520 和XAD-7HP 各10 mL，置于250 mL 具塞锥形瓶中，加入100 mL 浓度为C1的沙棘叶中总黄酮的样品液，在30 ℃下，放入培养箱中培养24 h，频率设定为130 n·min-1，过滤，可以得到滤中黄酮的浓度（C2）[9]。

树脂的静态吸附率计算公式如下：

式1 中：A吸附——吸附率，%；

C1——总黄酮初始浓度，mg·mL-1；

C2——总黄酮剩余浓度，mg·mL-1。

按下式计算静态饱和吸附量：

式2 中：M——吸附量，mg·g-1；

C1——总黄酮初始浓度，mg·mL-1；

C2——总黄酮剩余浓度，mg·mL-1；

V——树脂体积，mL；

M——树脂质量，g。

2.4.2 静态解析率的测定

将吸附达到饱和状态的树脂过滤，用蒸馏水清洗树脂，除去残留的溶液，精确加入70%的乙醇溶液100 mL，震荡处理24 h，然后将解吸液过滤出来，测定其中的总黄酮含量，以此来计算其解吸率[10]。

解吸率计算公式如下：

公式3 中：B——解吸率，%

Cn——洗脱液浓度，mg·mL-1；

Vn——洗脱液的体积，mL；

M——静态饱和吸附量，mg·g-1；

m——树脂质量，g。

2.5 洗脱条件及静态吸附条件的确定

2.5.1 吸附温度对沙棘叶总黄酮吸附量的影响

取15 mL 经预处理的树脂，装入到250 mL 三角瓶，加入100 mL 含有沙棘叶总黄酮的溶液，震荡处理10 h，进行吸附，温度设定为15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃和55 ℃。计算总黄酮的浓度，从而算出吸附率和吸附液浓度，以此得出最优吸附温度[11]。

2.5.2 吸附时间对沙棘叶总黄酮吸附量的影响

取15 mL 经预处理的树脂，装入到250 mL 三角瓶，加入100 mL 含有沙棘叶总黄酮的溶液，在45 ℃下震荡10 h，进行吸附。每隔1h 收集上清液，计算总黄酮的浓度，从而算出吸附率和吸附液浓度，以此得出最优吸附时间。

2.5.3 洗脱温度对沙棘叶总黄酮解吸率的影响

量取15 mL 吸附总黄酮达到饱和状态的树脂7份，用去离子水对其进行清洗，置于7 支250 mL 的三角瓶中，分别加入100 mL 75%的乙醇，将温度调节为15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃和55 ℃，振荡洗脱10 h。收集上清液，检测其中总黄酮含量，计算出解吸率，由解吸率得出最适洗脱温度。

2.5.4 洗脱时间对沙棘叶中总黄酮解吸率的影响

量取15 mL 吸附总黄酮达到饱和状态的树脂，用去离子水对其进行清洗，置于250 mL 的三角瓶中，加入100 mL 75%的乙醇，温度为25 ℃，震荡洗脱10 h，每1 h 吸取上清液，检测其中总黄酮含量，计算出解吸率，由解吸率得出最适洗脱时间。

2.5.5 乙醇浓度对沙棘叶中总黄酮解吸率的影响

量取15 mL 吸附总黄酮达到饱和状态的树脂，用去离子水对其进行清洗，置于250 mL 的三角瓶中，分别加入100 mL 浓度为25%、35%、45%、55%、65%、75%乙醇100 mL，震荡洗脱10 h。检测其中总黄酮含量，计算出解吸率，由解吸率得出最适乙醇浓度。

2.6 大孔树脂动态吸附试验

2.6.1 上样速率对总黄酮吸附效果的影响

将已制好的150 mL 树脂湿法装入色谱柱（40 cm×2.0 cm）中，将总黄酮粗提液作为上样液，并且控制粗提液流出液的速度，分别为1.0、2.01、3.0、4.0、5.0、6.0 mL·min-1，收集流出液，采用HPLC 法检测，当洗脱液浓度与上样液浓度相同时，停止上样，计算其中所含总黄酮的量，通过总黄酮的量及流出液的体积计算出每毫升树脂所能够吸附总黄酮的量，从而确定最佳速率。

2.6.2 上样液浓度对总黄酮吸附效果的影响

采用湿法进行树脂装柱，取已制好的150 mL 树脂装入色谱柱（40 cm×2.0 cm）中，将总黄酮粗提液作为上样液，浓度为0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mg·mL-1，吸附速率保持不变，收集流出液，采用HPLC 法检测，当洗脱液浓度与上样液浓度相同时，停止上样，计算其中所含总黄酮的量，通过总黄酮的量及流出液的体积计算出每毫升树脂所能够吸附总黄酮的量，从而确定最佳浓度。

2.6.3 洗脱液乙醇浓度对总黄酮吸附效果的影响

采运用湿法将树脂装入色谱柱，在最优吸附条件进行初级树脂吸附，使树脂达到饱和状态。再对流出液进行清洗，使其在波长450 nm 的条件下没有吸收峰，然后用5%、25%、45%、65%、85%的乙醇洗脱，速率为3 BV·h-1，乙醇的体积为4 BV。对流出液进行高效液相色谱检测，得出解吸率，确定乙醇的最优浓度。

2.6.4 解吸速率对树脂作用效果的影响

对树脂进行饱和吸附处理，再对流出液进行清洗，使其在波长450 nm 的条件下没有吸收峰，分别取洗脱速率1、2、3 、4 和5 BV·h-165%的乙醇对树脂进行洗脱处理，洗脱液的体积为4 BV。对流出液进行高效液相色谱检测，得出解吸率，确定最佳解吸速率。

2.6.5 洗脱剂用量对总黄酮吸附效果的影响

对树脂进行饱和吸附处理，再对流出液进行清洗，使其在波长450 nm 的条件下没有吸收峰，再用65%的乙醇溶液对其进行洗脱，速率为3 BV·h-1，洗脱液体积为1、2、3、4 和5 BV。计算出对应的解吸率，确定洗脱剂的最佳用量。

3 试验结果与分析

3.1 树脂的初筛

静态试验得出7 种树脂的解吸及吸附结果，如表1 所示：

表1 大孔树脂静态试验结果Table 1 The results of the static experiment

由表1 可知，树脂X-5 的吸附量、吸附率及解吸率都是七种树脂中最高的，故具有较好的吸附能力。而树脂AB-5 和D3520 的吸附能力稍差，但优于其他四种树脂。选取树脂X-5、AB-5 和D3520 来进行静态吸附及解吸的试验，由此确定最优树脂材料。

3.2 树脂洗脱条件及静态吸附条件的选择

3.2.1 吸附温度的确定

吸附温度与吸附率的影响关系如图2 所示。由图可以知，当吸附温度在15～25 ℃范围内，吸附率随温度的增加而增大，当温度达到35 ℃之后，吸附率开始下降，之后随着温度的升高而不断减小，这是由于较高的温度会使黄酮性质不稳定，从而影响吸附效果。在25 ℃时，三种树脂的吸附率达到最大，其中树脂X-5 的吸附率最大，吸附效果最好，此时为最适吸附温度。

图2 吸附温度与吸附率的关系图Fig.2 The relationship between adsorption temperature and adsorption rate

3.2.2 吸附时间的确定

吸附时间对吸附率的影响如图3 所示，由图可知吸附时间与三种树脂的吸附率成正比，时间增加吸附率增大，但当吸附时间达到3 h 后，吸附率出现小幅下降。吸附时间为3 h 时，三种树脂的吸附率都达到最大值，其中X-5 的吸附率最高，故吸附时间3 h为吸附的最适时间。

图3 吸附时间与吸附率的关系图Fig.3 The relationship between adsorption time and adsorption rate

3.2.3 洗脱温度的确定

图4 为洗脱温度和洗脱效果的关系图。图4 中，当洗脱温度在15～25 ℃之间时，洗脱率随洗脱温度的升高而增大，在25 ℃时分别达到最大值，其中树脂AB-8 增幅最大，但此时树脂X-5 洗脱率最大。当温度超过25 ℃后，洗脱率随洗脱温度的升高而不断减小。故25 ℃为最适洗脱温度。

图4 洗脱温度对洗脱率影响Fig.4 The effects of temperature on the rate of elution

3.2.4 洗脱时间的确定

图5 是洗脱时间和洗脱率的关系图。图中三种树脂的洗脱率都随洗脱时间的增加而增大，当洗脱时间为2.5 h 时，树脂的洗脱率达到最大值，之后便不再增加，趋于平稳。当洗脱时间为2.5 h 时，X-5 的洗脱率最高，为最优树脂，2.5 h 为最适洗脱时间。

3.2.5 乙醇浓度的确定

图6 是乙醇浓度与解析率的关系图。由图可知，随着乙醇浓度的不断增加，三种树脂的解析率也随之增大，当乙醇浓度为65 ℃时解析率达到最大值，其中树脂X-5 的解析率最大。

图5 洗脱时间对洗脱率的影响Fig.5 The effects of the elution time to the elution rate

图6 乙醇浓度与解吸率的关系图Fig.6 The relationship between concentration of ethanol and desorption rate

由上述试验可确定，树脂X-5 为沙棘叶总黄酮分离的最佳树脂，具有较高的吸附量、吸附率及解吸率。最优静态吸附的条件为：吸附温度25 ℃，吸附时间3 h；最优静态解析条件为乙醇浓度65%，解析温度为25 ℃，解析时间2.5 h。

3.3 大孔树脂动态吸附试验结果

3.3.1 上样速率的确定

表2 为上样速率与总黄酮吸附量的影响。表中所示，树脂X-5 的吸附量随上样速率的增加而不断减小，最大值为8.39 mg·mL-1，最小值为4.51 mg·mL-1。工业生产上既要考虑生产速率，也要考虑生产效率，由此选择上样速率2 BV·h-1为最优上样液的流速。

表2 上样液流速与树脂吸附总黄酮量的关系Table 2 The relationship between sample flow velocity and adsorption capacity

3.3.2 上样液浓度的确定

表3 为上样液浓度与树脂吸附量的关系。由表3 可知，树脂的吸附量随着上样液浓度的增加而不断增大，当上样液浓度为3 mg·mL-1时，吸附量达到最大值，之后吸附量开始不断降低，上样浓度过低，树脂没有对黄酮吸附完全，而上样浓度过高会使树脂堵塞，影响吸附效果。故选取上样液的浓度为3 mg·mL-1。

表3 上样液浓度与树脂吸附总黄酮量的关系Table 3 The relationship between sample concentration and adsorption capacity

3.3.3 乙醇浓度的确定

表4 为乙醇的浓度与解吸率的关系。解吸率随着乙醇浓度的增加而不断升高，当浓度为85%时，解吸率达到最大值，为88.1%，但当乙醇浓度为65%时，解吸率为87.3%与最高时的解吸率相差不大，但乙醇的浓度降低很多，工业生产时要同时考虑效率及成本，故选用75%的乙醇进行洗脱操作。

表4 乙醇浓度与树脂解吸率的关系Table 4 The relationship between ethanol concentration and desorption rate

3.3.4 解吸速率的选择

解吸速率与解吸率的关系见表5。当解吸速率为1.0 BV·h-1时，解吸率为86.3%，随着解吸速率的增大，解吸率逐渐降低，当解吸速率为5.0 BV·h-1时达到最低值72.9%。故当解吸速率为1.0 BV·h-1时，解吸率为最大值86.3%，但此时解吸速率较低，导致试验时间延长，效率下降，故3.0 BV·h-1为最佳解吸速率。

表5 解吸速率与树脂解吸率的关系Table 5 The relationship between desorption rate and desorption rate

3.3.5 洗脱剂用量的选择

表6 为洗脱剂乙醇的用量与解吸率的关系。由表可知，随着洗脱体积的增加，解吸率也不断增大，成正比例关系。洗脱剂用量为1.0 BV 时，解吸率为42.8%，当洗脱剂用量为4.0 BV 时，解吸率增大到86.3%，之后解吸率增长幅度不大，过多的洗脱剂会影响后续工艺。因此，考虑到生产成本及洗脱效果，洗脱剂的用量选取4.0 BV。

表6 洗脱剂的用量与树脂解吸率的关系Table 6 The relationship between the amount of eluent and resin desorption rate

由上述试验可得出，树脂X-5 对沙棘叶中总黄酮的动态吸附最优条件及其解吸的最适条件。

4 结论

试验对D101、XAD-7PH、D3520、NKA-9、X-5、D4020、AB-8 七种树脂的吸附率及解吸率研究，得出X-5 树脂分离沙棘叶总黄酮的效果最好。确定树脂在25℃条件下吸附2h 时的静态吸附效果最好；当树脂在25 ℃，洗脱液乙醇的浓度为65%的条件下树脂的静态解吸效果最好。试验得出：在上样液浓度为3.0 mg·mL-1，吸附速率为3 BV·h-1的条件下，树脂的动态吸附效果最佳；洗脱液乙醇的体积分数为65%，体积用量为4.0 BV，解吸速率为3 BV·h-1的条件下，获得沙棘叶总黄酮的纯度为89.72%，总黄酮含量由10.51 mg·mL-1增大到16.73 mg·mL-1，分离的效果较好。研究结果为利用大孔树脂分离沙棘叶总黄酮的应用提供了理论支持。

［1］杨喜花，陈敏，朱蕾，等.超声循环提取沙棘叶中总黄酮的研究［J］.农业机械学报，2006，37（3）：166-168.

［2］滕晓萍，温中平，王宏昊，等.沙棘叶研究进展综述［J］.国际沙棘研究与开发，2010，8（3）：17-20.

［3］焦岩，常影，刘井权.沙棘黄酮提取与分离技术研究综述［J］.食品工业，2012，33（8）：115-118.

［4］Zhmyrko T G，Gigienova E I，Vmarov A V.Vitamins From the Oils of Hippophae rhamnoides fruit ［J］.Khim Prir Soedin，1978（3）：313-317.

［5］赵玉芬，李佩艳，郑小林，等.大孔树脂对红薯叶总黄酮的吸附及解吸特性研究［J］.生物技术进展，2013，3（6）：433-438.

［6］钱慧碧，辛秀兰，兰蓉，等.大孔吸附树脂分离纯化越橘果渣总黄酮的研究［J］.吉林农业大学学报，2009，31（5）：611-615.

［7］闫克玉，于静.大孔吸附树脂法纯化杭白菊总黄酮［J］.现代食品科技，2008，24（1）：35-38.

［8］徐凤英，梁英，王亚飞.超声波辅助乙醇提取咖啡因工艺优化［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2013，25（2）：85-87.

［9］王晶，周禾.植物黄酮类化合物生物学功能及浸提纯化［J］.中国饲料，2006，17（11）：24-27.

［10］应雪，陈文，江发涛，等.大孔吸附树脂分离纯化甘草总黄酮工艺研究［J］.中国药房，2006，17（17）：1355-1357.

［11］杨武英，上官新晨，杨勇，等.大孔树脂精制芦荟叶黄酮的研究［J］.江西农业大学学报，2010，32（1）：169-174.