用HPLC法测定小鼠血浆中盐酸二甲双胍的浓度

宋丹丹，曹秀琴，沈佳伟，周玮丽

(上海市闵行区吴泾医院药剂科，上海 200241)

盐酸二甲双胍(metformin hydrochloride, MET)是临床上治疗2型糖尿病最常用的药物之一。它主要通过增加肌肉、脂肪等周围组织对葡萄糖的摄取和利用来降低血糖，而非刺激胰岛素分泌，从而可起到保护已受损的胰岛B细胞的作用，有利于糖尿病的长期控制。目前报道的测定MET血浆浓度的HPLC法，存在灵敏度低[1]，使用柱转换系统烦琐[2]，样品预处理过程复杂等不足之处。本研究建立一种测定小鼠血浆中MET浓度的反相离子对HPLC法，具有灵敏度高、方法简单快速、样品预处理过程简便有效、洗脱时间合理等特点。应用此方法可开展MET在小鼠体内药动学和生物利用度的研究。

1 仪器和材料

1.1 仪器 L-2000高效液相色谱仪(日本Hitachi公司)，含L-2130泵、L-2200自动进样器、L-2300柱温箱、L-2400 UV检测器、D-2000 Elite HPLC色谱工作站；LaChrom C18色谱柱(日立高新技术公司)；AL 104分析天平、FE20 Plus pH计(梅特勒-托利多公司)； Master-S超纯水仪(上海和泰公司)。

1.2 药品和试剂 盐酸二甲双胍对照品(纯度100.0%，中国食品药品检定研究院，批号100664-200602)。甲醇(色谱纯，德国默克公司)；高氯酸、磷酸二氢钠、十二烷基硫酸钠(SDS)(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)。

1.3 动物 KM小鼠(上海斯莱克实验动物责任有限公司，合格证号2007000546508)，雄性，体重(25±2) g。动物常规饲养，实验前夜禁食不禁水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 LaChrom C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(含10 mmol/L SDS和10 mmol/L NaH2PO4，pH=5.2)-甲醇(40∶60)；流速：1.0 ml/min；柱温30 ℃；检测波长：233 nm。

2.2 储备液、对照品及血浆样品的准备 精密称取适量MET对照品置于25 ml容量瓶中，加甲醇溶解配成1000 μg/ml的MET对照品储备液，4 ℃保存。小鼠经眼球后静脉丛取血，置于肝素化的EP管中，860×g离心10 min，取上层血浆置于-20 ℃保存。吸取MET对照品储备液适量，用小鼠空白血浆稀释制成质量浓度为200 μg/ml的MET对照品溶液，再以空白血浆分别稀释成0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/ml 7个标准系列浓度。将0.5、2.0、8.0 μg/ml 3个浓度作为低、中、高浓度质控样品(QC)。所有制备的样品包括QC在内检测前置于-20 ℃保存。

2.3 样品预处理 取2.2项下制备的血浆样品150 μl，加入30%高氯酸溶液9 μl置于离心管中，涡旋1 min混合均匀，13 680×g离心10 min，取上清液进样分析，进样量10 μl。

2.4 方法学考察

2.4.1 特异性实验 取小鼠空白血浆、含MET的血浆进样测定，得到色谱图见图1。从图1可见，基线噪音较小，血浆中代谢物峰及其他内源性物质均不干扰MET的测定，分离完全且峰形较好，MET的保留时间约为7.5 min。信噪比(S/N)≥3时检测到的最低浓度为0.10 μg/ml。

图1 盐酸二甲双胍的HPLC谱图

2.4.2 标准曲线的制备 取2.2项下7个标准系列浓度的MET对照品溶液按2.3项方法预处理，分别进样测定，以MET的峰面积(Y)为纵坐标，以相应质量浓度(X)为横坐标，进行线性回归，得到标准曲线方程：Y=220 050X-16 675 (r=0.999 1，n=5)，表明在0.2～16.0 μg/ml范围内呈良好线性关系。

2.4.3 精密度实验 取低、中、高浓度QC样品，按血浆样品的处理方法进行操作，分别于1 d内5个不同时间点测定一批QC样品(每个浓度5份)，计算日内精密度；另连续测定3 d，每天测定1批QC样品， 计算日间精密度， 结果见表1。

表1 盐酸二甲双胍的精密度和回收率实验结果

表1 盐酸二甲双胍的精密度和回收率实验结果

浓度(ρB/μg·ml-1)日内RSD日间RSD方法回收率提取回收率室温放置稳定性RSD反复冻融稳定性RSD0．5 0．60 0．85106．56±0．5280．98±1．725．21 8．562．0 0．17 0．6597．09±0．1684．05±1．231．69 1．438．0 0．10 0．3890．50±0．1080．96±0．794．46 4．48

2.4.5 室温放置稳定性及血浆反复冻融稳定性实验 取低、中、高浓度QC血浆样品各5份，按血浆样品处理方法操作后，室温放置，分别于0、12、24 h进样检测，考察其制备后室温放置稳定性。血浆反复冻融稳定性：取低、中、高浓度QC样品各3批(每批低、中、高3个浓度各5份)，分别于第0、7、14天取出融化后测定一批，其余再次置于-20 ℃冷冻待下次检测，结果见表1。

3 讨 论

近年来有很多文献报道了MET血药浓度的测定方法，包括液质联用测定法(LC-MS/MS)[3-5]，液相色谱-电喷雾质谱联用法[6]，及采用UV或DAD检测的HPLC法。LC-MS/MS检测尽管提高了敏感性，但由于其复杂的技术要求及高额成本，并不适用于多数实验室检测。HPLC具有高效、快速、进样量小、溶剂消耗少等特点，因此广泛用于MET血药浓度的测定。MET的碱性和极性都很强，采用常规RP-HPLC检测难以获得理想的保留时间。在优化色谱条件时，依据文献调整流动相组成[7,8]，采用甲醇-磷酸盐缓冲溶液作为流动相，加入SDS与MET结合形成离子对，延长其在反相色谱柱中的保留时间。MET的紫外最大吸收波长为233 nm，而在此波长下血浆中的极性内源性物质会造成很大干扰。通过调节有机相与水相的比例以改变极性，最终确定流动相为磷酸盐缓冲液(含10 mmol/L NaH2PO4和10 mmol/L SDS，pH 5.2)-甲醇(40∶60)，在此条件下MET保留时间为7.5 min，保留时间适中，既能避免血浆中的内源性物质(保留时间2～4 min)的干扰，又不会因保留时间过长而延误实验时间、浪费溶剂。

在血浆样品处理过程中，MET与血浆结合率较低，但其极性较大，难以从血浆中萃取出来。Chen等[9]采用200 μl血浆中加入50 μl 10%高氯酸溶液沉淀蛋白质，涡旋离心后直接取上清液上样。本研究在参考文献的基础上，对比沉淀剂、加入的量及涡旋时间，最终采用150 μl血浆中加入9 μl 30%高氯酸涡旋混合1 min，无需添加甲醇或乙腈等蛋白质沉淀剂，即可将血浆蛋白质沉淀完全，亦无干扰峰出现。以该方法直接沉淀蛋白质进行血浆样品处理，比萃取法更简单、快速，适用于大样本血药浓度检测。

综上所述，本研究从实际条件出发，建立了线性关系良好、精密度与稳定性符合定量分析要求、灵敏度高、重现性好、简便经济的小鼠血浆中MET的含量测定方法，为临床进一步开展药动学研究提供了方法学基础。

致谢本研究得到复旦大学药学院卢建忠教授的大力支持和帮助，在此致以衷心的感谢！

【参考文献】

[1]王志强，黄学荪，吴继禹. RP-HPLC法测定人血浆中盐酸二甲双胍的血药浓度[J]. 海峡药学，2010，22(1)：159-161.

Wang ZhiQiang，Huang XueSun，Wu JiYu. Determination of hydrochloride metformin in human plasma by RP-HPLC[J]. Strait Pharm J,2010，22(1)：159-161. In Chinese with English abstract.

[2]廉江平，张 鹏，李小川，等. 盐酸二甲双胍缓释片的药代动力学及相对生物利用度研究[J]. 西北药学杂志，2007，22(5)：227-229.

Lian JiangPing，Zhang Peng，Li XiaoChuan，etal. Study of pharmacokinetics and relative bioavailability of metformin hydrochloride sustained-release tablets[J]. Northwest Pharm J，2007，22(5)：227-229. In Chinese with English abstract.

[3]王 慧，邓 杰，易中宏，等. 高效液相色谱-串联质谱法测定犬血浆中盐酸二甲双胍浓度[J].中国药师，2008，11(11)：1325-1327.

Wang Hui，Deng Jie，Yi ZhongHong，etal. Determination of metformin hydrochloride in dog plasma by LC-MS/MS[J]. China Pharmacist，2008,11(11)：1325-1327. In Chinese with English abstract.

[4]张 丹，王国才，黄建权，等. 液相色谱-串联质谱法测定人血浆中二甲双胍的浓度[J]. 药物分析杂志，2011，31(2)：317-321.

Zhang Dan，Wang GuoCai，Huang JianQuan，etal. Determination of metformin in human plasma by LC-MS/MS[J]. Chin J Pharm Anal，2011，31(2)：317-321. In Chinese with English abstract.

[5]赵晓华，宋 波，钟大放，等.液相色谱-串联质谱法同时测定人血浆中二甲双胍和格列吡嗪[J].药学学报，2007，42(10)：1087-1091.

Zhao XiaoHua，Song Bo，Zhong DaFang，etal. Simultaneous determination of metformin and glipizide in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Acta Pharm Sinica，2007，42(10)：1087-1091. In Chinese with English abstract.

[6]王大为，武 洁.液相色谱-电喷雾质谱联用法测定人血浆中二甲双胍[J].药物分析杂志，2007，27(9)：1367-1369.

Wang DaWei, Wu Jie. Determination of metformin in human plasma by LC/ESI-MS-MS[J]. Chin J Pharm Anal，2007,27(9):1367-1369. In Chinese with English abstract.

[7]皮喜田，肖 霄，彭承琳，等. HPLC测定比格犬血浆中的盐酸二甲双胍及其药物动力学研究[J]. 华西药学杂志，2008，23(5)：575-577.

Pi XiTian，Xiao Xiao，Peng ChengLin，etal. Determination of metformin hydrochloride in Beagle dog’s plasma by HPLC and its application[J].West China J Pharm Sci,2008，23(5)：575-577. In Chinese with English abstract.

[8]李发胜，池晓峰，刘海日，等. 盐酸二甲双胍在小鼠体内的药动学和组织分布[J]. 中国药房，2010，21(5)：423-425.

Li FaSheng，Chi XiaoFeng，Liu HaiRi，etal. Pharmacokinetics and tissues distribution of metformin hydrochloride in mice[J]. China Pharmacy，2010，21(5)：423-425. In Chinese with English abstract.

[9]Chen Ye，Li HanQing，Xu JiaoJiao，etal. Determination of metformin in diabetic rat plasma by an improved ion-pair high-performance liquid chromatography: application to a pharmacokinetic study[J]. J Chin Pharm Sci，2012,21(3):211-218.