用液相色谱-质谱联用法同时测定人血浆中阿司匹林和氯吡格雷的浓度

易丽昕，马海英

(1.中国医科大学附属第四医院药学部，沈阳 110032；2.中国医科大学药学院，沈阳 110001)

阿司匹林具有抗凝血、抑制血小板活性的作用，小剂量阿司匹林被广泛用于防治缺血性心脑血管疾病[1]。氯吡格雷是一种噻吩并吡啶类抗血小板药，其活性代谢产物有抑制血小板聚集的作用。研究发现，长期预防性应用氯吡格雷和阿司匹林有益于预防心肌梗死、脑卒中等心脑血管疾病的发生[2]，但同时也有增加出血发生率、减少中性粒细胞等风险[3]，因此两药联用时有必要监测血药浓度。目前，同时测定氯吡格雷和阿司匹林血药浓度的文献不多，采用HPLC法测定操作繁琐，并且氯吡格雷血药浓度低，HPLC法测定尚不够准确[4]。本研究采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)法同时测定中国医科大学附属第四医院病人阿司匹林和氯吡格雷的血药浓度，为临床血药浓度监测提供了新方法。

1 仪器和试药

1.1 仪器 LC-10 ATvp液相色谱输液泵、2010 EV型单重四极杆质谱仪(ESI源)、LC-MS Solution 3.0工作站(日本岛津公司)；800型台式低速离心机(江苏省金坛市中大仪器厂)；HC-2518R高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司)；FA1004N万分之一电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2 药品和试剂 阿司匹林、氯吡格雷、苯甲酸的对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为100113-201104、100819-201104、100419-201302)；甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙酸、二氯甲烷(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；水为重蒸水(中国医科大学附属第四医院药学部自制)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件与质谱条件 (1)色谱条件：色谱柱为Kromasil C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液(60∶40)；柱温30 ℃；流速0.8 ml/min；进样量20 μl。(2)质谱条件：离子源为电喷雾电离源(ESI)，接口温度400 ℃，脱溶剂气温度 250 ℃，加热块温度200 ℃，雾化气(N2)流速2.5 L/min，干燥气(N2)流速2.0 L/min，检测电压1.5 kV。采用正离子模式检测，扫描方式为选择性离子监测(SIM)，用于定量分析的离子分别为m/z322.1(氯吡格雷)、m/z178.9(阿司匹林)和m/z121.1(内标苯甲酸)。

2.2 溶液的配制 (1)对照品储备液：精密称取氯吡格雷和阿司匹林对照品适量，用甲醇溶解并稀释成含氯吡格雷10 μg/ml和阿司匹林250 μg/ml的混合对照品储备液，置4 ℃冰箱保存，备用。(2)内标溶液：精密量取苯甲酸对照品适量，用甲醇溶解并稀释为50 μg/ml的内标储备液。精密量取内标储备液适量，用甲醇稀释至浓度为10 μg/ml的内标溶液，置4 ℃冰箱保存，备用。(3)对照品系列溶液：精密量取混合对照品储备液适量，用甲醇稀释成阿司匹林浓度分别为0.5、2、10、40、100、250 μg/ml，氯吡格雷浓度分别为0.05、0.2、0.5、2、5、10 μg/ml的对照品系列溶液，置4 ℃冰箱保存，备用。

2.3 血浆预处理 取1 ml待测血浆，加内标溶液20 μl、二氯甲烷3 ml，涡旋振荡3 min，以100.62×g离心10 min。取上清液置另一试管中，于40 ℃水浴中氮气流下吹干，残渣用200 μl流动相溶解后，超声1 min，涡旋振荡1 min，以1.509×104×g离心5 min后，取上清液，作为血浆样品溶液。

2.4 方法专属性考察 阿司匹林、内标(苯甲酸)、氯吡格雷经离子化(ESI源)，主要生成[M+H]+准分子离子峰，m/z分别为178.9(阿司匹林)、121.1(内标苯甲酸)和322.1(氯吡格雷)。全扫描质谱图见图1。

图1 全扫描质谱图

取空白血浆1 ml，除了不加内标外，其他按2.3项下操作，得到空白血浆样品溶液。将一定浓度(含阿司匹林40 μg/ml，氯吡格雷2 μg/ml)的对照品溶液20 μl和内标溶液20 μl加入1 ml空白血浆中，按2.3项下操作，得模拟血浆样品溶液。取病人血浆1 ml，按2.3项下操作，得待测血浆样品。把空白血浆样品、模拟血浆样品和待测血浆样品分别进样测定，得到色谱图，见图2。由图2可见，阿司匹林、内标(苯甲酸)和氯吡格雷的保留时间分别约为 2.0、2.4和3.2 min，空白血浆对药物和内标出峰无干扰，方法专属性强。

图2 血浆样品的LC-MS谱图

2.5 标准曲线的制备 取空白血浆1 ml，加入2.2项(3)对照品系列溶液20 μl，配制成系列浓度分别为阿司匹林10、40、200、800、2000、5000 ng/ml，氯吡格雷1、4、10、40、100、200 ng/ml的模拟血浆样品。按2.3项方法预处理后，进样测定，记录峰面积。以药物浓度(X)为横坐标，待测物与内标峰面积比值(Y)为纵坐标，用加权最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程：阿司匹林Y=0.012 9X+0.030 5(r=0.996 8)，线性范围10～5000 ng/ml，定量下限10 ng/ml；氯吡格雷Y=0.003 5X+0.000 7(r=0.997 8)，线性范围1～200 ng/ml，定量下限1 ng/ml。

2.6 精密度实验 取空白血浆1 ml，分别加入混合对照品储备液适量，得到低、中、高浓度(阿司匹林40、800、4000 ng/ml，氯吡格雷4、40、160 ng/ml)的质控样品。每一浓度取5份样本进行分析，连续测定3 d，根据当日的标准曲线方程，分别计算质控样品中阿司匹林和氯吡格雷的浓度，并计算RSD，结果见表1。由表1可见，本方法的日内和日间RSD均<15%，符合对生物样品的检测要求。

表1 精密度和回收率实验结果

2.7 回收率实验 取2.6项低、中、高浓度的质控样品，每一浓度取5份样本进行分析。另取空白血浆1 ml，除了不加内标溶液外，其余按2.3项方法预处理，向获得的上清液中加入低、中、高浓度的对照品溶液20 μl和内标溶液20 μl，使阿司匹林终浓度为40、800、4000 ng/ml，氯吡格雷终浓度为4、40、160 ng/ml，按2.3项方法预处理后进样分析。以提取后的峰面积与未经提取测得的峰面积之比计算提取回收率，见表1。内标溶液经同样提取处理，平均提取回收率为(80.1±4.2)%(n=5)。

2.8 稳定性实验 考察低、中、高浓度(阿司匹林40、800、4000 ng/ml，氯吡格雷4、40、160 ng/ml)的质控样品在室温放置24 h，预处理后在进样器中放置12 h，经过3个冷冻-解冻循环，-20 ℃保存15 d的稳定性。结果RSD均<15%(n=5)，表明质控样品在上述条件下保存，稳定性良好。

2.9 临床应用 选取本院神经内科2013年1-9月长期口服阿司匹林片和氯吡格雷片且肝、肾功能正常的病人10例，于清晨空腹采集肘静脉血，应用本研究建立的LC-MS法测定阿司匹林和氯吡格雷的血药浓度。测得阿司匹林血药浓度为100～900 ng/ml，氯吡格雷血药浓度为5～30 ng/ml。

3 讨 论

作者在研究过程中考察了沉淀蛋白质法和液液萃取法对血浆样品的提取效果。采用甲醇、乙腈等试剂对血浆样品进行沉淀蛋白质处理，结果样品溶液中杂质较多，基质对主药出峰影响大，故改用液液萃取法进行处理。提取溶剂考察了二氯甲烷、乙醚和乙酸乙酯，其中二氯甲烷提取回收率高，干扰小，故最终选用二氯甲烷作为提取溶剂。由于受基因多态性等因素的影响，阿司匹林和氯吡格雷的体内代谢存在广泛的个体差异[5,6]，因此在临床应用时应注重个体化给药。目前，多采用HPLC法测定阿司匹林和氯吡格雷的血浆浓度，缺点是操作繁琐，并且氯吡格雷血药浓度较低，应用常规的HPLC法并不能准确测定。本研究建立的LC-MS法操作简便，重复性好，灵敏度高，可同时测定阿司匹林和氯吡格雷的浓度，能用于临床血药浓度监测。

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