慢性乙型肝炎患者外周血调节性B细胞与调节性T细胞的表达频率及其相关性

杨鸿林，金洁，蒋廷旺

（1.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013；2.吴江区第一人民医院检验科，江苏苏州215200；3.常熟市医学检验所，江苏苏州215500）

慢性乙型肝炎患者外周血调节性B细胞与调节性T细胞的表达频率及其相关性

杨鸿林1，2，金洁1，蒋廷旺3

（1.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013；2.吴江区第一人民医院检验科，江苏苏州215200；3.常熟市医学检验所，江苏苏州215500）

目的：分析慢性乙型肝炎患者外周血IL-10＋CD19＋调节性B细胞（regulatory B cells，Breg）与CD4＋CD25high调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）的比例及两者的相互作用。方法：收集急性乙肝（acute hepatitis B，AHB）患者28例，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者31例和健康体检者（健康组）25例。分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），经CpG ODN 2006和佛波酯体外作用后，流式细胞术分析Breg、Treg的表达及其相关性，ELISA检测培养上清IL-10水平。通过免疫磁珠剔除CD4＋CD25＋T细胞后分析Breg与Treg表达频率间的相关性。结果：CpGODN 2006和佛波酯作用后CHB组Breg和Treg百分率较AHB组和健康组均明显升高（Breg：P值分别为0.003和0.001；Treg：P值分别为＜0.001，0.005），AHB组和健康组间两类细胞表达频率差异无统计学意义（Breg：P＝0.796；Treg：P＝0.227）；Spearman相关性分析显示CHB组Breg与Treg表达百分比存在正相关关系（r＝0.50，P＝0.004），而AHB组和健康组无此相关性（r＝－0.15，P＝0.462；r＝0.09，P＝0.669）。CHB组IL-10表达高于AHB组和健康组（Z值分别为－6.596、－6.373，P均＜0.001），AHB组和健康组间差异无统计学意义（Z＝－0.952，P＝0.341）。Spearman相关性分析表明CHB组IL-10与Breg存在正相关关系（r＝3.303，P＝0.005）。CHB组患者Breg和IL-10的表达在剔除CD4＋CD25＋T细胞前后间的差异无统计学意义。结论：Breg和Treg在CHB患者中表达频率升高，Breg可能通过IL-10的分泌参与慢性乙肝的免疫调节，且该作用不依赖于Treg。

调节性B细胞；慢性乙型肝炎；调节性T细胞；IL-10

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）进入人体后，细胞免疫应答在病毒清除过程中发挥了重要作用。研究发现，HBV慢性感染患者特异性T细胞免疫应答往往受到抑制，对病毒呈现免疫低反应性，但是其确切的机制仍不清楚［1－2］。

B细胞在自身免疫病、感染、肿瘤等疾病中具有调节T细胞应答的功能，而多项研究提示IL-10可能是B细胞发挥免疫调节作用的主要介质［3－4］。这种能够分泌IL-10的B细胞近年来被命名为调节性B细胞（regulatory B cells，Breg）［5］。然而，Breg在HBV感染过程中的免疫调节作用目前报道较少，且机制尚不明确。本研究旨在探讨Breg和调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）在慢性乙肝中的表达频率及其相关性。

1 对象与方法

1.1 对象

急性乙型肝炎（acute hepatitis B，AHB）和慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的临床诊断参考2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的《病毒性肝炎防治方案》中的急性乙肝和慢性乙肝诊断标准［6］。选择AHB患者28例，CHB患者31例。健康对照组选择年龄性别相匹配的健康体检者25例。所有研究对象排除甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒和艾滋病病毒的交叉感染且无自身免疫性疾病。

1.2 细胞培养

抽取患者及对照者外周血10 mL，EDTA-K3抗凝，立即用淋巴细胞分离液（上海国药公司）分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），RPMI 1640培养基（10%胎牛血清，4 mmol／L谷氨酰胺，100 U／mL青霉素，100μg／mL链霉素）调整PBMC至1×106／mL，培养于24孔板中。培养液中加入免疫佐剂CpG ODN 2006（上海生工生物技术公司）至0.1μmol／L，作用72 h后再以5 ng／mL佛波酯（PMA）作用6 h。

1.3 流式细胞分析

收集培养的细胞以2 mL预冷磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤2次。应用以下抗体进行胞内和胞膜染色：IL-10-PE，CD19-APC，CD4-FITC，CD25-PE（均购自美国BD公司）。未经刺激的细胞和同型对照用于反映染色的特异性。以FACSCalibur四色流式细胞仪及CellQuest Pro软件（美国BD公司）获取并分析IL-10＋CD19＋Breg和CD4＋CD25highTreg的表达频率。

1.4 ELISA法测定PBMC培养上清中IL-10含量

收集PBMC细胞的培养上清，采用ELISA试剂盒（美国eBioscience公司）测定IL-10含量，操作按照说明书进行。

1.5 统计方法

以SPSS 17.0软件进行统计分析，偏态分布资料用中位数和四分位数［M（P25-P75）］表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。两组连续变量间的相关性采用Spearman相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-10＋CD19＋Breg和CD4＋CD25highTreg的表达频率

各组患者PBMC经CpG ODN 2006和PMA作用后，结果显示AHB组、CHB组和健康组Breg百分率分别为10.30%（7.05%～13.30%）、14.30%（10.70%～16.70%）和10.40%（6.85%～12.60%）。其中CHB组Breg的表达明显高于AHB组和健康组（Z值分别为3.006和3.462，P值分别为0.003和0.001）；AHB组与健康组间的差异无统计学意义（Z＝0.258，P＝0.796）。见图1。

CHB组CD4＋CD25highTreg的比例为5.80%（4.20%～9.10%），明显高于AHB组［4.05%（2.53%～5.40%）］和健康组［4.50%（2.55%～5.50%）］（Z值分别为3.683和2.837，P值分别＜0.001和0.005）。健康组Treg比例与AHB组比较，差异无统计学意义（Z＝1.088，P＝0.227）。见图2。

图1 外周血PBMC经CpG作用后IL-10＋CD19＋B细胞占CD19＋B细胞的比例

图2 外周血PBMC经CpG作用后CD4＋CD25high Treg细胞占CD4＋T细胞的比例

2.2 IL-10＋CD19＋Breg与CD4＋CD25highTreg表达频率的相关性

CpG作用后，将各组IL-10＋CD19＋Breg与CD4＋CD25highTreg的表达频率进行相关性分析发现，CHB组Breg与Treg的表达频率间存在显著相关性（r＝0.50，P＝0.004），而AHB组和健康组中Breg与Treg的表达频率则无相关性（r＝－0.15，P＝0.462；r＝0.09，P＝0.669）。见图3。

图3 慢性乙肝组Breg与Treg表达频率的相关性

2.3 CHB组IL-10的表达

体外刺激后，ELISA分析PBMC细胞培养上清，结果发现AHB组、CHB组和健康组的IL-10含量分别为5.8（0～7.5）pg／mL、26.7（21.3～33.5）pg／mL、6.4（5.0～8.2）pg／mL。CHB组IL-10的表达明显高于AHB组和健康组（Z值分别为－6.596、－6.373，P均＜0.001）。AHB组和健康组间差异无统计学意义（Z＝－0.952，P＝0.341）。Spearman相关性分析表明，CHB组IL-10与Breg存在正相关关系（r＝3.303，P＝0.005），AHB组和健康组内无此相关性（r值分别为0.296、0.158，P值分别为0.127、0.450）。

2.4 CD4＋CD25＋T细胞清除前后Breg百分率和IL-10含量的变化

通过免疫磁珠法剔除10例CHB患者PBMC中CD4＋CD25＋T细胞后，进行同样的体外刺激，结果如图4所示，清除前后Breg百分率和细胞培养上清IL-10水平并无明显变化（Z＝－0.038，－0.151；P＝0.970，0.880）。

图4 慢性乙肝组Breg和IL-10表达在CD4＋CD25＋T细胞清除前后的变化

3 讨论

我们分离患者PBMC并以CpG和PMA在体外活化其中的B细胞，发现体外刺激后CHB组患者Breg比例较AHB组和健康组明显升高。CpG ODN是TLR9的配体，可以促进B细胞的活化和增殖，而相关研究表明CpG ODN具有促进初始状B细胞与HBV表位结合的潜在作用［7］。由此可见，CHB患者的IL-10＋CD19＋Breg经体外诱导后相对于AHB患者和健康人增殖能力更强。Breg主要通过分泌IL-10对其他免疫细胞发挥免疫调节作用，通过抑制CD4＋T细胞的增殖和IFN-γ的分泌调节T细胞免疫应答。因此，我们分析了细胞培养上清中IL-10细胞因子的分泌情况，发现CHB患者中IL-10含量明显升高，并且与Breg存在相关性。这说明在HBV慢性感染过程中Breg活化后能够分泌大量IL-10参与免疫调节。CD4＋CD25＋Treg也可以分泌IL-10，在维持外周免疫耐受的过程中同样具有重要的作用。因此，我们选择部分CHB病例对其PBMC中CD4＋CD25＋Treg进行清除后再进行体外作用，发现Treg清除前后IL-10＋CD19＋Breg比例和IL-10含量并无明显变化，且清除前慢性乙肝组IL-10＋CD19＋Breg比例和IL-10水平存在明显相关性。这说明本研究中IL-10主要来源于活化的IL-10＋CD19＋Breg，同时也提示Breg的表达频率不受Treg的影响。

最近的研究表明，分泌IL-10的B细胞可能具有诱导产生Treg的作用［8－9］。而且多项研究证实CHB患者外周血Treg比例升高。为了了解CHB中Breg与Treg之间的关系，我们通过分析各组CD4＋CD25highTreg的比例发现，CHB组Treg表达频率高于其他两组，且Breg与Treg的表达频率间存在正相关。通过剔除CHB组PBMC中CD4＋CD25＋T细胞的研究发现，剔除前后Breg比例无明显变化。该结果提示CHB中Breg对Treg可能具有调节作用，而Treg对Breg的比例则无影响。然而，我们仅仅分析了Treg的表达频率及其与Breg之间的相关性，尚不足以证明两者之间是否存在必然的因果关系，但是这一结果至少可以提示CHB中IL-10＋CD19＋Breg与CD4＋CD25highTreg有一定的联系，为进一步研究两者之间的关系提供了思路。

［1］Maini MK，Boni C，Ogg GS，et al.Direct ex vivo analysis of hepatitis B virus-specific CD8＋T cells associated with the control of infection［J］.Gastroenterology，1999，117（6）：1386－1396.

［2］Webster GJ，Reignat S，Brown D，et al.Longitudinal analysis of CD8＋T cells specific for structural and nonstructural hepatitis B virus proteins in patientswith chronic hepatitis B：implications for immunotherapy［J］.J Virol，2004，78（11）：5707－5719.

［3］Mauri C，Gray D，Mushtaq N，et al.Prevention of arthritis by interleukin 10-producing B cells［J］.J Exp Med，2003，197（4）：489－501.

［4］Mizoguchi A，Mizoguchi E，Takedatsu H，etal.Chronic intestinal inflammatory condition generates IL-10-producing regulatory B cell subset characterized by CD1d upregulation［J］.Immunity，2002，16（2）：219－230.

［5］Bouaziz JD，Le Buanec H，Saussine A，et al.IL-10 producing regulatory B cells inmice and humans：state of the art［J］.Curr Mol Med，2012，12（5）：519－527.

［6］中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案［J］.中华肝脏病杂志，2000，8（6）：324－329.

［7］许洪林，王四清，王世峰，等.两种CpG基序能高度活化人免疫细胞［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2001，21（5）：471－475

［8］Mauri C.Regulation of immunity and autoimmunity by B cells［J］.Curr Opin Immunol，2010，22（6）：761－767.

［9］Mauri C，Bosma A.Immune regulatory function of B cells［J］.Annu Rev Immunol，2012，30：221－241.

Expression and roles of regulatory B cells and T cells in patients w ith chronic hepatitis B

YANG Hong-lin1，2，JIN Jie1，JIANG Ting-wang3

（1.School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Departmentof Clinical Laboratory，the First People′s Hospital of Wujiang，Suzhou Jiangsu 215200；3.Institution for Laboratory Medicine of Changshu，Suzhou Jiangsu 215500，China）

Objective：To investigate the expression and roles of IL-10＋CD19＋regulatory B cells（Breg）and CD4＋CD25highregulatory T cell（Treg）in patientswith chronic hepatitis B.M ethods：A total of 28 patientswith acute hepatitis B（AHB），31 patients with chronic hepatitis B（CHB）and 25 normal subjects（HCs group）were enrolled in this study.Peripheral blood mononuclear cells（PBMC）were isolated and stimulated with CpGODN 2006 and PMA.The expression of IL-10＋CD19＋Breg and CD4＋CD25highTregwas analyzed with flow cytometry.The level of IL-10 in culture supernatantwas analyzed with ELISA.CD4＋CD25＋T cells were removed with Immunomagnetic beads to analyze the interactions between Breg and Treg.Results：After stimulation with CpG ODN 2006 and PMA，compared with the AHB group and the HCs group，percentages of Breg and Treg in the CHB group increased significantly（Breg：P＝0.003，0.001；Treg：P＜0.001，＜0.005），and no difference was found between the AHB group and the HCs group（Breg：P＝0.796；Treg：P＝0.227）.Spearman correlation analysis found that in the CHB group，Breg and Treg was positively correlated（r＝0.50，P＝0.004），but in the AHB group and the HCs group，there was no such correlation（r＝－0.15，P＝0.462；r＝0.09，P＝0.669）.IL-10 expression in the CHB group was higher than that in the AHB group and the HCs group（Z＝－6.596，－6.373，P＜0.001），and the difference between the AHB group and the HCs group was not statistically significant（Z＝－0.952，P＝0.341）.Spearman correlation analysis showed that in the CHB group，IL-10 and Bregwere positively correlated（r＝3.303，P＝0.005）.Before and after removal of CD4＋CD25＋T cells，in the CHB group，the difference between Breg and IL-10 expression was not statistically significant.Conclusion：The expression of Breg and Treg increased in patientswith chronic hepatitis B，Bregmight play a regulatory role by IL-10 secretion.

regulatory B cells；chronic hepatitis B；regulatory T cells；IL-10

R512.62

A

1671－7783（2014）01－0048－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130194

常熟市科技发展计划（社会发展）项目（CS201113）

杨鸿林（1977—），男，福建漳州人，主管检验师，主要从事临床检验学的研究；蒋廷旺（通讯作者），主管技师，E-mail：jtwgyp＠sina.com

2013－09－02 ［编辑］陈海林