GSTT 1基因多态性及吸烟与胃癌的关系

史剑权 骆宝建 刘荣英 陈言东

1.首都医科大学附属北京胸科医院重症医学科，北京 101149；2.包头医学院第二附属医院，内蒙古 包头 014030

胃癌（gastric cancer，GC）的发生是一个多因素、多阶段的过程，它与环境致癌物、个体的遗传易感性等因素密切相关，因此，与环境致癌物代谢有关的代谢酶（包括GST家族、CYP家族等）基因多态性的问题成了当前肿瘤研究的一个重要方向。GSTT1作为谷胱甘肽 S-转移酶 （glutathione-s-transferase，GSTs，EC2.5.1.18）家族的重要成员，其基因多态性（包括存在型和缺失型）与肿瘤的关系，也就引起了国内外学者的关注。近年来，国内外的研究报道表明GSTT1基因缺失型与肺癌[1]、肝癌[2]、胰腺癌[3]等多种肿瘤的易感性有关。关于GSTT1基因多态性与胃癌遗传易感性方面的研究，结论尚不统一[4]。本研究中，通过研究吸烟（环境因素）和GSTT1基因多态性（遗传因素）对胃癌发生的影响，为胃癌的病因研究以及一级预防提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

所有胃癌病例均来源于内蒙古消化病研究所（设于包头医学院第二附属医院）和包头市肿瘤医院。所有胃癌病例均由组织病理学检查确诊为胃癌。对照组的个体均来自于当地排除肿瘤病史的一般人群。所有标本收集的起止时间为2005年5月～2006年3月。胃癌组患者60例，男43例，女17例，年龄（55.60±8.14）岁；对照组83例，男53例，女30例，年龄（56.33±7.90）岁。胃癌组和对照组的年龄和性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 流行病学调查

由经过培训的医护人员，对所有研究对象（胃癌组和对照组）进行包括性别、年龄、吸烟情况的流行病学调查。对吸烟情况分为“不吸烟”和“吸烟”两种。其中，“吸烟”规定为每天至少吸1支烟，持续1年以上者，达不到这一标准者规定为“不吸烟”。

1.3 主要试剂

①Taq DNA 聚和酶，dNTPs，DNA Marker，无菌去离子水均购于加拿大上海Songon生物工程技术服务有限公司。②琼脂糖、EB、Tris、EDTA、硼酸、溴酚兰均购于北京鼎国生物技术有限公司。③DNA提取液：由内蒙古基因诊断研究所提供。

1.4 GSTT1基因型的检测

1.4.1 DNA的提取 取胃癌组患者及对照组的人外周血2 mL，置入加有EDTA的抗凝试管中，于半小时内置于-20℃低温冰箱中冷冻保存或立即进行基因组DNA的提取（提取方法由内蒙古基因诊断中心提供）。

1.4.2 PCR扩增 应用聚合酶链反应PCR方法扩增基因组DNA，参照文献[5]，构建GSTT1和β-珠蛋白基因的引物（表 1），其中，β-珠蛋白（268 bp）作为内对照。所有的引物序列均经美国生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI） 的序列比对工具 （basic local alignment search tool，BLAST） 的验证，并由加拿大上海Songon生物技术有限公司合成（PAGE纯化）。GSTT1基因引物序列为正义链5'-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3'， 反 义链 5'-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3'。β-珠蛋白基因引物序列为正义链5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'，反义链5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3'。PCR反应体系 15 μL，其中包括模板 DNA 3 μL，GSTT1 和β-珠蛋白的上下游引物（浓度为 25 μmol/L）各 0.3 μL、dNTP （浓度为 25 mM）0.3 μL、10×buffer 1.5 μL、Tag酶（浓度 5 U/μL）为 0.35 μL、MgCl2（浓度为 25 mM）1.3 μL、无菌去离子水 7.35 μL。上 PCR 仪，PCR 反应循环参数：95℃预变性 5 min，94℃变性 45 s，60e退火45 s，73℃延伸 45 s，共 36 个循环，最后再 73℃延伸10 min后终止扩增。

1.4.3 电泳 取PCR产物15 μL，加2 μL TEB缓冲液，3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。

1.5 统计学方法

所有的统计分析以及统计图的绘制均采用SPSS 13.0软件包。①计量资料的组间比较采用t检验，计数资料的组间比较采用χ2检验，双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。②吸烟、GSTT1基因型的联合作用与胃癌的关系采用分层分析，以比值比OR及其95%的可信区间（confidence interval，CI）表示相对危险度。

2 结果

2.1 GSTT1基因型的检测结果

GSTT1扩增产物的大小为480 bp，内对照β-珠蛋白产物的大小为268 bp，同时出现480 bp及268 bp两条带者即为GSTT1基因存在型，用GSTT1（+）表示；只出现268 bp一条带（β-珠蛋白基因）者为GSTT1基因缺失型，用 GSTT1（-）表示，见图 1。其中，1、3、4 泳道为 GSTT1基因存在型，2、5、6泳道为 GSTT1基因缺失型，M为marker。

图1 GSTT1和β珠蛋白基因PCR产物电泳结果

2.2 胃癌组及对照组GSTT1基因型分布的比较

分别对胃癌组60例和对照组83例进行了GSTT1基因检测，结果表明，胃癌组GSTT1（-）例数为34 例，GSTT1（+）例数为 26 例；同时，对照组中，GSTT1（-）例数为 33 例，GSTT1（+）例数为 50 例。GSTT1 基因缺失率为56.7%（34/60），明显高于对照组的39.8%（33/83），差异有统计学意义（χ2=3.998，P＜0.05）。携带GSTT1（-）基因型者发生胃癌的危险性是携带GSTT1（+）基因型者的 1.98 倍（OR=1.98，95%CI：1.01～3.89）。

2.3 胃癌组及对照组吸烟情况的比较

分别调查胃癌组和对照组的吸烟情况，结果发现，胃癌组中吸烟者的例数为39例，不吸烟的例数为21例；对照组中，吸烟者的例数为29例，不吸烟的例数为54例。胃癌组中吸烟者的比例为65.0%（39/60），高于对照组34.9%（29/83），组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。吸烟者发生胃癌的危险性是非吸烟者的 3.458 倍（OR=3.458，95%CI：1.723～6.939）。

2.4 GSTT1基因型及吸烟与胃癌的关系

2.4.1 根据是否吸烟分层分析GSTT1基因型与胃癌的关系 不吸烟人群中，胃癌组和对照组的GSTT1基因型分布差异无统计学意义（P ＞ 0.05），GSTT1（-）基因型未显著增加不吸烟者患胃癌的风险。吸烟人群中，胃癌组和对照组的GSTT1基因型分布差异有统计学意义（P＜0.05）；并且，吸烟人群中，GSTT1缺失型的人患胃癌的风险性是GSTT1存在型的4.75倍（P=0.003，OR=4.75，95%CI：1.68～13.41），即 GSTT1（-）基因型显著增加吸烟者患胃癌的风险。见表1。

表1 根据吸烟情况分层分析GSTT1基因型与胃癌的关系（例）

2.4.2 根据GSTT1基因型分层分析吸烟与胃癌的关系 GSTT1（+）人群中，吸烟者在胃癌组和对照组中的分布无显著性差异（P＞0.05），吸烟未明显增加GSTT1（+）人群患胃癌的风险。GSTT1（-）人群中，吸烟者在胃癌组和对照组中的分布差异有统计学意义（P＜0.05）；并且，GSTT1（-）人群中，吸烟者患胃癌的风险性是不吸烟者的 11.6 倍（OR=11.6，95%CI：3.516～28.266），即吸烟显著增加GSTT1（-）人群患胃癌的风险。见表2。

表2 根据GSTT1基因型分层分析，吸烟与胃癌的关系（例）

3 讨论

胃癌目前依然是导致恶性肿瘤相关死亡的第2位疾病[6]，具有发病率高、转移率高、病死率高、早期诊断率低、5年生存率低等特点[7]，给家庭和社会带来极大危害，因此，进行胃癌的病因学研究，筛选胃癌的易感基因和高危人群，对胃癌进行有效的一级预防（病因预防），就具有十分重要的意义。

谷胱甘肽转硫酶是人体内一组具有重要解毒作用的多基因酶家族，属Ⅱ相代谢酶；它参与致癌物的代谢，是体内重要的解毒机制[8]。目前，将人的胞浆型GSTs同工酶分为四种，即α、μ、π和θ，分别由不同的基因编码。编码GST-θ同功酶的GSTT1基因定位于人类22号染色体q11.23。GSTT1基因在人群中具有基因缺失多态性，可分为存在型GSTT1（+）和缺失型GSTT1（-），亦即一些人不具有GSTT1基因。大量研究表明，不同种族、不同地域的群体，GSTT1基因缺失型的频率差异很大，GSTTl基因缺失型在非洲、亚洲、欧洲人群中分布频率分别为 15%～26%、16%～64%和10%～21%[9]。本研究中，通过分析对照组，提示内蒙古地区一般人群GSTT1基因缺失频率为39.8%。

不具有GSTT1基因的个体，由于体内GSTT1基因的缺失，导致机体不能产生有活性的GST-θ同功酶，进而不能有效去除体内亲电子致癌物，这可能增加了体细胞突变的风险并最终导致肿瘤的形成[10]，所以，GSTT1基因多态性可能与癌症易感性有关。本实验中，胃癌组GSTT1基因缺失率为56.7%，显著高于对照组的39.8%，差异有统计学意义（P＜0.05）。携带GSTT1（-）基因型者发生胃癌的危险性比 GSTT1（+）者明显升高（OR=1.98，95%CI：1.01～3.89），提示GSTT1基因缺失型是胃癌的易感基因型。这与Palli等[11]、Zhao 等[12]学者的结论一致；但同时 Nguyen 等[13]、García-González等[14]报道胃癌组和对照组GSTT1基因型频度分布的差异无显著性。国外另一项Meta分析的结果显示[15]，GSTT1基因多态性对不同种族人群胃癌易感性的作用不同：在白种人中GSTT1缺失增加患胃癌风险，在黄种人中GSTT1缺失未增加患胃癌风险。不同作者报道不同种族、不同地区GSTT1基因多态性与胃癌易感性关系的研究结果的不一致，其原因是多方面的：不同地区、不同种族人群中环境因素、生活习惯、遗传特征的差异；胃癌是多种基因、多种环境因素长期相互作用的结果，某种致癌的环境因素可能会掩盖个体GSTT1基因缺失在胃癌发病过程中所起的作用；不同研究中样本选择、样本量大小、研究方法的差异。

烟草燃烧所产生的烟雾中，至少有43种为已知的致癌物[16]，吸烟是一种公认的致癌因素。本研究中，胃癌组的吸烟率明显高于对照组（P＜0.05），吸烟者相对非吸烟者，患胃癌的风险显著上升（OR=4.75），吸烟是胃癌的危险因素之一，这与Nomura等[17]的观点一致。同时，GSTT1编码的GST-θ同工酶在烟草中的致癌物：乙烯氧化物、环氧丁烷、烃类氧化物的解毒第二时相发挥作用，所以，GSTT1编码的酶的缺失将可能导致烟草中的有害致癌物的解毒障碍，增加相应人群致癌的危险性。近年来，代谢酶系基因多态性、吸烟与肿瘤易感性相互关系的研究备受关注。本研究中，通过两组分层分析（见表1、2）可看出：①GSTT1（-）基因型未明显增加不吸烟人群患胃癌的风险（P＞0.05）；但GSTT1（-）基因型会显著增加吸烟人群患胃癌的风险（OR=4.75，95%CI：1.68～13.41）。②吸烟未明显增加GSTT1（+）人群患胃癌的风险性（P＞0.05）；但吸烟会显著增加GSTT1（-）人群发生胃癌的风险（OR=11.6，95%CI：3.516～28.266）。GSTT1（-）基因型且吸烟的人，患胃癌的风险明显提高。GSTT1缺失基因型和吸烟协同作用，共同增加发生胃癌的风险。

总之，本研究认为，胃癌的发生涉及到多种环境因素及遗传因素长期的相互作用。在内蒙古地区，GSTT1缺失基因型是胃癌的易感基因型，吸烟是胃癌的危险因素之一，吸烟和GSTT1（-）基因在胃癌的发生中有协同作用。对于GSTT1基因缺失的这类胃癌的高危人群，应特别加强教育，使其改善生活习惯，尽量杜绝主动吸烟和被动吸烟，定期体检，预防胃癌的发生。

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