从粘细菌中寻找活性物质的研究方案

崔道林 陈春丽

【摘要】本文介绍了寻找生物活性物质的必要性和紧迫性，从粘细菌中寻找生物活性物质的优点，具体探讨了研究粘细菌活性物质的技术路线。

【关键词】粘细菌生物活性物质

【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2014）03-0033-01

随着环境污染的加剧和人类生活方式的变化，心脑血管疾病、恶性肿瘤、糖尿病、老年性痴呆症等疾病日益严重地威胁着人类健康，仅病毒病平均每年就新增2－3种。长久以来抗菌素被认为是治疗传染性疾病的神奇药物，然而近年来抗菌药物正在逐步丧失其神奇疗效。随着抗菌类药物的广泛使用，越来越多的病原菌产生了对一种甚至多种抗菌素的耐药性[1]。人类迫切需要寻找新的、特效的药物来治疗这些疾病。人们都纷纷把目光投向了生物活性物质，所谓生物活性物质，是指来自生物体内的对生命现象具有影响的微量或少量物质，主要包括药用物质、生物信息物质、毒素等生物体内的天然产物。此外，人们还希望利用生物活性物质开发出增进健康、预防疾病的营养食品、保健食品，有些生物活性物质还可用于化妆品中，有的可制成特殊的生物功能材料，使得生物活性活性物质成了研究热点。已经被人类开发的微生物资源如小单孢菌、放线菌和粘细菌等，在粘细菌中发现的生物活性物质的数量，仅次于放线菌，真菌和芽孢杆菌，而且从放线菌等微生物中筛选新生物活性物质的重复几率越来越高，而粘细菌在这方面具有独特的优势。就目前情况看，粘细菌中55%的菌株可产生生物活性物质，而溶纤维素群粘细菌甚至高达95%。这为新结构或新作用机制生物活性物质的筛选提供了很好的一类微生物资源。

1.粘细菌产生生物活性物质的优点

从已有的文献看，粘细菌产生的生物活性物质主要表现以下几个方面的特点：①种类多。包括芳香族、杂环类、醌类、大环类、聚醚类、多烯类、肽类化合物等，这一点与放线菌十分相似。1994 年Schummer 等人还分离到一种含硼生物活性物质。②结构新。目前分离到的60 多种基本结构中，仅有3 种是在其他微生物中报道过的。③一株菌可以产生一种基本结构的许多衍生物。例如， Sorangiumcell ulosum Soce 26 可产生50 多种soraphen 的衍生物；Myxococcus fulvus 产生的有35 种不同衍生物。④菌株特异性，而不是种或属特异性。目前粘细菌分类上已确定的仅有12个属约40个种，但包含许多菌株。同种的不同菌株产生生物活性物质的差异很大。另一方面，某些生物活性物质的产生菌的分布可跨越种、属、甚至科的界限。⑤不同类别的多种生物活性物质可由一个菌株同时产生。⑥粘细菌生物活性物质有许多是作用于真核细胞的，这一点在生物活性物质产生菌中是比较特别的。

2.研究粘细菌活性物质的技术路线

2.1粘细菌的分离

综合文献中的方法，用玻棒平整的一头印土样，然后转印在滤纸水琼脂平板的滤纸上，将接好土样的平板倒置放于30 ℃的恒温箱中培养。7d左右就可在土样周围观察到粘状物。将粘状物转接到滤纸水琼脂平板的滤纸上培养。3d后，转接到滤纸上的粘状物有明显的扩展，变厚。约7～10d后，可观察到子实体出现。

2.2粘细菌的液体培养与发酵产物的提取

从菌种的平板上挑出子实体接种到液体培养基，摇床培养3d作为种子液。以10 %的接种量接种到液体培养基，于30℃，160 rpm 培养2 d ，然后加入2 %(v/v) 高温灭菌后的SIPI28非极性大孔吸附树脂，继续在摇床中培养5d。

2.3发酵产物粗提取物的薄层层析分离

粗提物的分离采用硅胶薄层层析。层析板用薄层层析硅胶H(60 型) 制备，采用展层液(石油醚:丙酮=3:1)上行法展层。层析后，在紫外灯下观察。将点刮下，用甲醇洗脱。10000rpm离心，收集上清，挥发甲醇，得到分离物。

2.4进行ESL-MS分析

电喷雾质谱(ESI-MS)已发展成为一种通用的质谱技术，它是通过测定样品离子的质荷比(m/z)来进行成分和结构分析的方法，ESI-MS从一开始就成为了药学和生物医学研究领域重要的标志性工具，广泛地使用在组合化合物库的高通量筛选、杂质分析、药代动力学研究和代谢产物的确认，以及蛋白质结构特征的表达等各方面应用领域。

2.5抗菌谱测定

将通过薄层层析得到的分离物，用二甲亚砜溶解，将已灭菌的滤纸片放入浸泡1h ，取出后晾干备用。接着将各种待测菌或孢子悬液分别接种0.5mL 涂布平板，然后将滤纸片分别放在培养基表面，置培养箱培养。

粘细菌中令人感兴趣的是其基因组远较一般的细菌基因组大，约9454～10010 kb。大量的基因被“奢侈”地用来合成许多复杂的次级代谢产物对其自身的意义似乎是长期进化选择的结果。丰富次级代谢产物的合成作为粘细菌生长后期的主要细胞活动之一，与粘细菌细胞形态的发生有着密切的关系。有关工作的开展不但在资源利用方面具有重要意义，在理解生物进化等生命本质问题也有重要意义。

参考文献：

[1]Levy, S.B, Antibiotic resistance-the problem intensifies. Adv Drug Deliv Rev, 2005. 57(10): p. 1446-50.