高效液相色谱法测定玉米秸秆预处理过程的抑制物

魏 铭 王彩霞 邢建民

(1.北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700； 3.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190)

高效液相色谱法测定玉米秸秆预处理过程的抑制物

魏 铭1王彩霞2,3邢建民3

(1.北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700； 3.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190)

使用玉米秸秆发酵生产丁二酸，在预处理时会产生糠醛、4-对羟甲基苯甲醛、5-羟甲基糠醛、丁香醛等抑制物，抑制发酵过程的进行。通过建立4种抑制物的最佳高效液相分析方法，结果表明，在流动相比例为30%甲醇-70%超纯水、流速为0.8 mL/min时，采用YMC-Triart C18(250×4.6 mm L.D.)色谱柱，各物质的分离效果最好；分别绘制4种抑制物的标准曲线，显示各抑制物浓度在0.001～1.000 g/L范围内，回归方程的线性相关系数达到0.999以上，呈良好线性关系。采用该方法检测玉米秸秆预处理后抑制物的浓度，发现稀酸预处理和高温水热预处理产生的抑制物浓度基本相同。

玉米秸秆；丁二酸；抑制物；高效液相色谱

丁二酸(succinic acid)，又名琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，与其他二元酸不同，丁二酸分子包含2个活泼的亚甲基，因此具有许多化学特性，如卤化、脱水、氧化、还原、酯化、酰化、磺化等[1]。作为一种重要的有机化工原料及中间体，丁二酸广泛应用于农业、医药业以及食品业[2-3]。传统的化学方法生产丁二酸主要是采用丁烷为原料，产生中间体顺丁烯二酸酐，然后在催化剂的作用下进行加氢反应，得到终产物丁二酸，虽然这种方法生产工艺相对比较成熟，但要消耗不可再生的石化资源，而且对环境造成污染，严重抑制了丁二酸作为大宗化学品的发展潜力[4-6]。

发酵法是指微生物菌种以可再生糖源(如农作物秸秆、糖蜜)为主要原料，通过发酵过程生产丁二酸，该方法成本低廉，环境友好[7-8]。近年来，由于石油危机及环境污染的双重压力，微生物发酵法生产丁二酸以其具有节约大量的石油资源并且可以降低由石化方法产生的污染等优点，而受到广泛关注，成为国内外研究的热点。目前，利用秸秆为原料生产丁二酸已经取得了令人鼓舞的研究进展，但是具体操作过程依然存在一些有待解决的难题，最突出的问题在于对秸秆进行预处理时，会产生一些阻碍菌体生长的抑制物，如糠醛、羟甲基糠醛等，这些抑制物使得酶解效率降低，进而影响到后续的发酵过程[9-11]。因此，本研究通过确立4种常见抑制物(糠醛、4-对羟甲基苯甲醛、5-羟甲基糠醛、丁香醛)的液相分析条件,建立各物质的液相标准曲线，以期实现抑制物在发酵样品中的精确检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

糠醛(西陇化工股份有限公司)；4-对羟甲基苯甲醛(国药集团化学试剂有限公司)；5-羟甲基糠醛(阿法埃莎(天津)化学有限公司)；丁香醛(阿法埃莎(天津)化学有限公司)；以上试剂均为色谱纯。

全温摇瓶柜(HYG-A，太仓市试验设备厂)；蒸汽灭菌锅(LDZX-75KBS，上海申安医疗器械厂)；超纯水仪(EASYPURE Ⅱ，Thermo)；离子色谱(ICS-900，戴安)；离心机(Mini spin，Eppendorf)；pH电极(DELTA 320，METTLER)；无菌操作台(SW-CJ-LF，苏净安泰)；紫外分光光度计(U-2910，日立)；超低温冰箱(-86℃ ULT，Thermo)；旋涡混合器(XH-C，金坛市医疗仪器厂)；超声波清洗器(KQ2200E，昆山市超声仪器有限公司)；反应釜控制仪(VHF，山东威海自控反应釜有限公司)；厌氧培养箱(YQX-Ⅱ，上海新苗医疗器械制造有限公司)。

1.2 标准曲线的测定

将流动相甲醇和超纯水的比例设为5个梯度(30%甲醇-70%超纯水，35%甲醇-65%超纯水，40%甲醇-60%超纯水，45%甲醇-55%超纯水，50%甲醇-50%超纯水)，流速设为3个梯度(0.6、0.8、1.0 mL/min)，用4种抑制物(糠醛，4-对羟甲基苯甲醛，5-羟甲基糠醛，丁香醛)的混合标准溶液(0.500 g/L)分别进样，检测分离度。

将4种抑制物分别配成浓度为1.000、0.500、0.200、0.100、0.005、0.001 g/L的标准溶液，之后分别进样(进样量：10 μL)，绘制标准曲线。同时用糠醛和5-羟甲基糠醛的标准溶液(0.500 g/L)重复进样5次，进行精密度验证。

1.3 玉米秸秆不同预处理后抑制物含量的测定

1.3.1 稀酸预处理 将粉碎的天然干燥秸秆过40目筛后，在500 mL的三角瓶中称取22.5 g秸秆，用300 mL去离子水溶解，使得秸秆的固含量为7.5%(每100 mL的溶液中有7.5 g的秸秆装入量)，小心加入1 mL浓硫酸(加入后浓度为1%)，混匀，封口。放入灭菌锅中，于121 ℃处理90 min。结束后，对样品抽滤，实现固液分离，得到的固体即为稀酸预处理后的物料。称取少量固体放入烘箱，剩余固体和液体分别放入4℃冰箱。

1.3.2 高温水热预处理 将粉碎的天然干燥秸秆过40目筛后，称取11.25 g于250 mL的三角瓶中，用150 mL水溶解(使其固含量为7.5%)。混匀后，倒入反应釜控制仪中，185 ℃处理40 min[12]。结束后，对样品抽滤，实现固液分离，称取少量固体放入烘箱，剩余固体和液体分别放入4℃冰箱。

将所有固液分离得到的液体取样，稀释10倍后，检测主要抑制物的浓度。

1.4 分析方法

标准曲线的测定使用美国安捷伦科技公司的Agilent 1200系列液相色谱分析仪。紫外检测器：DAD JP62359428；分析柱：YMC-TriartC18(250×4.6 mm L.D.)；柱温：室温；进样量：10 μL。

玉米秸秆预处理后抑制物的检测使用美国安捷伦科技公司的Agilent 1200系列液相色谱分析仪。紫外检测器：DAD DE64257480；分析柱：HPX-87H(BioRad,USA)，300×7.8 mm；柱温：50 ℃；流动相：硫酸(0.005 mol/L)；流速：0.6 mL/min；进样量：10 μL。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

以甲醇和超纯水为流动相，考察流速为0.6 mL/min时不同流动相比例对4种抑制物分离度的影响，结果见图1。

由图1可知，甲醇比例为30%时，各物质得到了很好的分离，此时保留时间最长为32.5 min。随着流动相中甲醇比例的增大，保留时间提前且间隔变短，分离效果变差。特别是甲醇比例为40%和45%时，后2个峰粘连在一起，出现重叠，不能很好地分离。而甲醇比例为50%时，一种物质无明显响应值，无法检测其存在。因此，流动相的比例选择为30%甲醇-70%超纯水。

不同流速下各物质的液相分离图谱见图2，从图2中可以看出，流速为0.6 mL/min时，尽管各物质实现了较好的分离，但保留时间拖后太多，不利于后面试验的开展；流速为1.0 mL/min时，保留时间最短，但是由于流速过快导致柱压较高(流速0.6 mL/min时柱压为119 bar，流速0.8 mL/min时柱压为136 bar，流速1.0 mL/min时柱压为144 bar)，会缩短色谱柱的使用寿命。因此，流速选择为0.8 mL/min。

2.2 标准曲线的绘制

按照2.1中建立的色谱分析方法进行4种抑制物的含量测定，并绘制标准曲线，结果见图3。从图3中看出，各物质标准曲线R2均在0.999以上，在0.001～1.000 g/L范围内呈现出良好的线性关系。

选取糠醛和5-羟甲基糠醛2种物质的标准溶液(0.5 g/L)进行精密度试验，并根据回归方程计算出标准液浓度。由表1～2可知，保留时间及2种标准品浓度的相对标准差均在5%以下，故本试验具有良好的重现性，色谱条件合理。

表1 糠醛测定的重复性试验

2.3 玉米秸秆预处理试验结果

将稀酸预处理和高温水热预处理后固液分离得到的液体样品，按照2.1建立的方法，进行抑制物浓度的检测，检测结果见图4。根据该结果换算出各物质的浓度，见表3。结果表明，稀酸和高温水热2种预处理方式产生的主要抑制物浓度差别不大，由此预测其对酶解过程产生的抑制作用基本相同。

表3 秸秆预处理后各抑制物的浓度

3 结 论

采用甲醇-超纯水为流动相对发酵抑制物进行高效液相色谱分析，当甲醇与超纯水的比例为30%～70%，流速为0.8 mL/min时，可以使糠醛、4-对羟甲基苯甲醛、5-羟甲基糠醛、丁香醛四种抑制物得到较好的分离。以上物质在0.001～1.000 g/L呈现良好的线性关系，并通过精密度验证。用此方法对玉米秸秆不同预处理后的抑制物含量进行测定，结果显示，2种预处理方式产生的抑制物浓度基本相同。

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(责任编辑 曹 龙)

Determination of Inhibitors in Pretreatment Corn Straw by Using High Performance Liquid Chromatography

WEI Ming1, WANG Cai-xia2,3, XING Jian-min3

(1.College of Biological Sciences and Technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China; 2.Institute of Traditional Chinese Medicine,China Academy of Chinese Medical Science,Beijing 100700,China; 3.National Key Laboratory of Biochemical Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China)

In the process of getting succinic acid from by corn straw fermentation, furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 4-Hydroxybenzaldehyde and syringaldehyde always appears at pretreatment stage. This paper established an optimum method by high performance liquid chromatography to analyze these four inhibitors. Results showed that inhibitors were well-separated under the optimized mobile phase (30%methanol- 70% ultrapure water) with a flow rate of 0.8 mL/min on the YMC-Triart C18 column. The Standard curves of four inhibitors indicated that the concentration of all inhibitors was range of 0.001-1.000 g/L, the linear correlation coefficients were above 0.999. The concentration of these inhibitors produced in corn stover pretrearment was measured by using the methods and the result showed that, the concentration of inhibitors produced in the processes of pretreatment of dilute acid and pretreatment of hydrothermal was same.

corn straw; succinic acid ; inhibitor；HPLC

2014-05-13

国家高技术研究发展计划863项目(2012AA101807，2011AA02A203，2012AA022301)资助。

邢建民(1967—)，男，博士，研究员。研究方向：生物催化与代谢工程。Email：jmxing@home.ipe.ac.cn。

10.3969/j.issn.2095-1914.2014.06.015

S784

A

2095-1914(2014)06-0085-06

第1作者：魏铭(1991—)，女，硕士生。研究方向：食品生物技术。Email：bjfuweiming@163.com。