土壤中PVA降解菌的分离与筛选

强雪妮，郭雅妮，杨 贞

（西安工程大学 环境与化学工程学院，陕西 西安710048）

聚乙烯醇（PVA）是一种人工合成的水溶性高分子聚合物，具有良好的水溶性、成膜性、黏结性，被广泛应用于纺织、印染、化纤等多个领域［1］.但由于其化学耗氧量大，可生化性差，生物降解周期长［2］，每年有大量的PVA废水产生，造成了严重的环境污染，极大地危害了生态环境.因此，PVA废水的治理受到越来越多人的重视，其中生物处理方法具有降解效率高且无二次污染等优点，因此得到了学者们的广泛关注［3］.筛选出能降解PVA的优势菌，对于含PVA废水土壤的处理具有十分重要的意义.

目前国内外许多学者分离出多株降解PVA的微生物［4－8］，其中以假单胞菌属较多，芽孢杆菌和不动杆菌较少.同时还有学者对微生物降解PVA的机理、提取和纯化PVA降解酶也进行了相关研究［9－10］.但大多数关于微生物降解PVA的研究多以水体中的降解菌为主，对于土壤中的PVA降解菌的研究不是很多.本文从含PVA土壤中分离筛选出能降解PVA的菌株，并对其进行生理生化鉴定，以期为PVA的生物降解寻找新的菌种来源，完善土壤微生物降解PVA的理论依据.

1 实 验

1.1 菌种

菌种来自于含PVA的土壤样品.

1.2 材料

1.2.1 试剂 （1）PVA（化学纯，醇解度为99.8%～100%，天津科密欧化学试剂有限公司），其他试剂均为分析纯.

（2）硼酸－碘－碘化钾显色剂：I液：称取2.5g KI，置于100mL棕色容量瓶中，加蒸馏水溶解后称取0.65g碘加入其中，定容备用.Ⅱ液：称取4g硼酸置于100mL容量瓶，定容至刻度.将I液和Ⅱ液按1∶5比例（1mL I液和5mLⅡ液）混合即成.

（3）细菌形态观察及生理生化实验所用试剂参见文献［11］.

1.2.2 培养基（1）筛选培养基：PVA 1.0g，NH4Cl 1.0g，酵母膏 0.1g，KH2PO40.2g，K2HPO41.6g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.02g，CaCl20.05g，NaCl 0.02g，蒸馏水1 000mL，pH＝7.2，121°C灭菌20min.

（2）发酵培养基：PVA 2.0g，NH4Cl 3.0g，KH2PO40.25g，K2HPO42.0g，MgSO4·7H2O 0.06g，Fe－SO4·7H2O 0.02g，CaCl20.05g，NaCl 0.02g，蒸馏水1 000mL，pH＝7.2，121°C灭菌20min.

（3）种子培养基：PVA 1.0g，酵母膏1.6g，KH2PO40.2g，K2HPO41.6g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.02g，CaCl20.05g，NaCl 0.02g，蒸馏水1 000mL，pH＝7.2.

（4）生理生化实验所用培养基参见文献［11］.

1.3 方法

1.3.1 降解PVA混合菌系的分离 将采集到的土壤样品取1.0g置于0.1mol／L的NaCl溶液中混匀，再取10mL置于装有100mL筛选培养基的250mL锥形瓶中，于30℃，200r／min下振荡培养3天后，由摇瓶中吸取2mL混合培养物移入装有100mL筛选培养基的250mL三角瓶中，重复几次后，检测、比较不同培养体系中PVA含量的变化，选择其中PVA含量下降最多的混合培养物继续培养.

1.3.2 PVA降解菌的筛选与鉴定 （1）光圈法初筛.将菌株点种于选择培养基平板培养2天，浸入6～8mL显色剂（硼酸－碘化钾－碘试剂），置室温避光与培养基中PVA充分反应20min，然后观察透明圈的有无和大小.有，则表示有酶活；越大，则表示酶活越高.透明圈较大的单菌落保存于NA斜面中，划线纯化后，4℃保存备用.

（2）复筛.利用平板菌落计数法调整初筛所获菌株菌悬液浓度.取10mL原菌液放入90mL无菌水中，充分振荡，按此方法逐级稀释，取10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－66个稀释度分别涂平板，每组2个平行样，30°C恒温培养，测定PVA的降解效率.

（3）鉴定.将得到纯化后的4株菌株进行革兰氏染色，在400倍显微镜下观察其菌体形态，具体染色方法步骤参照文献［11］，并进行一系列生理生化实验，以鉴定菌种.

1.3.3 PVA降解率的测定 采用H.Jodeph报道的碘量法［12］测定.取一定量的降解液，4 000r／min离心20min，取上清液5mL并稀释10倍后取出5mL，加6mL显色剂，再加20mL的蒸馏水摇匀，显色20min.在比色皿中，以蒸馏水为参比，测定聚乙烯醇与显色剂形成的有色物质在690nm的吸光度，每24h测一次，所测得的吸光度与标准曲线对比得到PVA含量.

式中 Ao为空白试样（未接种培养基）的吸光值；Ai为降解试样的吸光值.

2 结果与讨论

2.1 菌种分离筛选及降解条件优化

将分离纯化得到6株菌分别编号A，B，C，D，E，F，在筛选培养基上于30℃培养2～3天后，观察其菌落特征，6株菌在分离实验中菌落周围均能产生透明圈，即表示6株菌体内均有PVA降解酶.菌落特征如表1所示.6株菌株经过5天的降解，对PVA的降解情况如图1所示.

由图1可知，6株降解菌的降解率最高达到47.6%，最低30%.降解率由大到小依次为E＞F＞C＞A＞B＞D，因此简化实验，舍去B，D两组，以A，C，E，F作为后续研究对象，继续培养5天，其降解情况如图2所示.

由图2可知，4株菌体在2g／L的PVA发酵培养基中经过5d的培养，A的降解率由31.6%提高到40.2%，C，E，F的降解效率均有所下降.降解率的大小依次为A＞F＞E＞C.将A，C，E，F 4组纯种菌落分别接入到3g／L的PVA发酵培养基中继续驯化，结果见图3.

图1 初筛菌在2g／L的PVA发酵培养基中的降解

图2 复筛菌在2g／L的PVA发酵培养基中的降解

图3 4株菌在3g／L的PVA发酵培养基的降解

图4 4株菌在4g／L的PVA发酵培养基中的降解

将图2和图3进行比较，可以看出A，C，E，F 4组细菌对PVA的降解效果由大到小的排序为A＞C＞F＞E，菌种A的降解率略有提高，C有大幅度提高，F组的降解率也略有提高，E组略有下降.为了提高菌落的驯化速度，将菌落分别接入到4g／L的发酵培养基中，并连续驯化8天后，再将菌种分别接种于对应的3g／L的PVA发酵培养基中，并测定其吸光度，得到图4.

由图4可知，A，C，E，F的降解率经过8天的驯化后，降解率均有了进一步的提高.降解率由大到小的顺序为A＞F＞E＞C，且A菌的降解率达到了61%，最低的C菌也达到了48.4%.经过这一系列的驯化，发现传统的驯化方式已不能很好地提高PVA降解菌的降解效率，因此停止驯化.之所以降解效率不高，分析原因主要有两点：一是菌种来自于土壤，土壤中PVA降解菌在水体降解中受到环境因素的影响；二是PVA降解菌菌种来源单一.后期实验中从不同样品源采集多种样品，增加PVA降解菌菌种的多样性，以达到更高的PVA降解效率.

3.2 细菌细胞形态及生理生化实验结果

经过对A，C，E，F 4株PVA降解菌革兰氏染色，在400倍显微镜下观察，如图5所示，细菌的生理生化实验结果见表2.参照《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）和《一般细菌常用鉴定方法》，以及以上细菌生化实验结果，判定A为假单胞菌属，C为球菌属，E为微球菌属，F为链球菌属.

表2 细菌细胞形态及生理生化实验结果

3 结 论

（1）通过对土壤中PVA混合菌系的一系列驯化和筛选，得到4株PVA降解单菌，降解效率在48%～61%之间，证明土壤中存在PVA降解菌，但须进一步驯化以提高降解率.

图5 4株PVA降解菌显微镜照片

（2）通过细菌形态和生理生化实验表明4株PVA降解单菌中A为假单胞菌属，C为球菌属，E为微球菌属，F为链球菌属.

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